/ 复旦大学分析测试中心

0 引言

拉曼光谱是一种基于分子极化率变化的分子振动光谱，具有无损、高灵敏度、高分辨力，可在线检测等优点。近年来，随着纳米材料与生物医学的不断发展，拉曼光谱越来越多地被应用到生物医学研究领域[1]。JY/T 002-1996《激光喇曼光谱分析方法通则》及2016年《激光拉曼光谱分析方法通则》征求意见稿中虽提出了液体和固体样品检测的指导意见，但对于生物样品如细胞及组织切片等复杂样品的检测未能给出检测标准或指导意见。随着当前拉曼光谱对生物样品（如细胞和组织切片等样品）的研究不断增多，由于该类样品自身信号微弱，研究者发现承载生物样品的基底材料的信号在所采集到的样品的拉曼散射信号中有了明显的贡献，从而会对生物样品的拉曼光谱检测结果产生明显干扰。同时，传统拉曼光谱的检测在选择基底时是选择无明显拉曼散射信号或信号微弱的材料作为基底，如玻璃（信号微弱）或氟化钙（600 cm-1以后无拉曼散射信号），但随着拉曼光谱材料科学（如表面增强拉曼光谱）的发展与拉曼光谱在生物医学领域应用的不断拓展，研究者发现某些基底材料虽然没有明显拉曼光谱的信号，但在某些情况下基底材料仍然贡献了不可忽略乃至很强的背景信号。同时，随着近年来表面增加拉曼光谱（SERS）技术及微纳米加工技术的不断进步与发展，已有多种商品化的具备拉曼光谱增强效果的SERS活性基底芯片可供科研人员选择。然而，这些基底由于价格昂贵、易氧化且不可重复利用等原因，尚未能大规模被科研人员利用在生物样品的检测领域。同时，这些芯片材料主要是以光滑的硅片或二氧化硅玻璃为支撑基底，在其表面修饰具有拉曼光谱增强能力的金、银的纳米结构，从而制备出具备SERS增强效果的固体基底。然而这些活性基底材料的支撑基底仍多为二氧化硅，故在实际样品检测过程中也有可能需要考虑二氧化硅等的背景信号的影响。综上所述，研究不同基底材料在不同的检测条件下的背景信号，并研究这些信号与基底材料的拉曼光谱信号之间的关联性，进而明确基底的选择标准具有现实意义。本文通过研究六种较为常见的不同基底材料的拉曼光谱以及发射光谱，确定了这些材料在不同拉曼光谱检测条件下的适用性，并通过总结，提出了拉曼光谱基底材料的选择条件。

1 测量系统的构成

生物样品的拉曼光谱检测系统由拉曼光谱的显微系统（物镜）和承载有生物样品的基底构成，如图1所示，整个系统置于减震平台上，基底置于显微物镜下。若生物样品为活体或含水检测，需定时在基底上添加相应的缓冲液。将基底放置于显微物镜下，通过物镜的观察，调节物镜台将物镜聚焦样品表面。通过拉曼光谱仪控制软件，设定激光波长、检测范围和扫描时间等参数，并控制拉曼光谱信号的采集。图2和图3分别为显微镜视野下的癌细胞与病理组织切片。

图1 显微拉曼光谱仪显微系统与细胞培养皿

图2 显微镜视野下的癌细胞

图3 显微镜视野下的病理组织切片

本文所用拉曼光谱仪为Horiba Jobin Yvon公司的XploRA型激光显微拉曼光谱仪，激发光波长可选532 nm和785 nm，拉曼光谱测试范围设定为200～4 000 cm-1，散射光谱测试范围设定为535～1 000 nm，信号采集方式为180°背散射检测，扫描时间为1 s平均10次，或者30 s。

2 方法依据与方法分析

由于拉曼光谱及拉曼光谱仪在检测过程中具有不损伤样品，不受样品中水分的影响，较高的空间分辨力，以及提供检测对象丰富的结构信息等特点[2][3]，同时随着近年来纳米材料的发展，特别是表面增强拉曼光谱标记技术的发展[4]，拉曼光谱越来越多地被运用到生物样品（如细胞、组织切片等样品）的分析与研究中。在进行拉曼光谱样品检测时，需将样品放置于基底如载玻片上，再放置于显微镜下进行检测。常规样品由于密度较高且厚度足够厚可确保激发光无法穿透样品，因而在通常情况下无需考虑承载样品的基底信号。但在检测生物样品时，情况却有所不同。一方面，因为生物样品通常厚度很薄（细胞厚度在数十微米，超薄组织切片厚度为数十微米至数百微米）且密度较低（主要成分为水），检测时激发光已可穿透样品并照射至承载基底；另一方面，随着SERS标记技术[5]的发展，越来越多的用于标记细胞及组织表面特定位点的SERS标记物的工作激光被优化为波长较长的激光（如波长为633 nm和785 nm的激光），所以，面对生物样品时，必须考虑基底材料自身的信号，尤其是特定波长下的基底信号，以明确基底背景信号的干扰。

由于在没有荧光干扰、共振和增强的情况下，拉曼光谱的散射峰位置及比例关系与激发光波长无关[6]，故通常情况下拉曼光谱仪的激发光选取任意波长的激光即可，而常规基底选用几乎没有强拉曼散射信号的钠钙玻璃载玻片。钠钙玻璃载玻片的拉曼光谱信号如图4（1）所示，其自身拉曼光谱信号谱峰范围有限且信号强度微弱，几乎不用考虑其信号作为背景信号的干扰。然而，随着近年来纳米技术及在生物领域内应用的不断拓展，单一激发光特别是短波长的激光已经无法满足这些领域的需求。当使用能够满足上述应用领域的激光如638 nm或785 nm等较长波长激光做激发光时，尤其是用785 nm的激光检测载玻片的时候，发现载玻片的非拉曼信号，如硅钙玻璃结构中的氧空穴发光，见图4（2），已经成为无法忽略的背景信号，甚至可能对样品的定性及定量检测结果造成干扰。基于上述现象，本文考察并分析了包括载玻片在内的六种基底的拉曼信号与其他光致发光信号，指出这些材料作为基底的适用范围及基底的选择方法，进而对JY/T 002-1996《激光喇曼光谱分析方法通则》及2016年《激光拉曼光谱分析方法通则》提出补充，以期促进拉曼光谱的标准化使用。

2.1 测量步骤

1）将基底材料放置于拉曼光谱仪的样品台上；

2）调节样品台位置，将待检测物置于物镜下；

3）调节样品台高度，使视野内的待检测物边界清晰，即使待检测物置于物镜焦点；

图4 532 nm（1）和785 nm（2）波长激光激发下测得的载玻片拉曼光谱图

4）在拉曼光谱仪中设定好检测范围、扫描时间和激光波长等参数，开始检测，获取拉曼散射信号和发光信号。

2.2 基底材料拉曼光谱信号的影响

目前最常用的基底材料是以硅钙玻璃为原料的载玻片和以聚丙烯为原料的培养皿，分别用来承载组织切片和细胞样品。一方面由于对透光性能的要求不断提升，另一方面随着近年拉曼光谱在生物领域越来越广泛的运用，越来越多的材料被用作生物材料承载基底。本文选取了六种材料（如图5），分别为载玻片、培养皿、蓝宝石玻璃、石英玻璃、氟化钙片和氟化钡片，将这六种材料置于拉曼光谱仪下，用波长为532 nm的激光，按2.1的步骤检测它们的拉曼光谱信号，检测结果如图6所示。从图6中可以看到，在532 nm下，载玻片、氟化钙和氟化钡在400 cm-1后均没有明显的拉曼信号，石英玻璃至800 cm-1后才无明显信号，而培养皿和蓝宝石玻璃有明显的信号。上述结果表明载玻片、氟化钙和氟化钡具有低拉曼光谱信号的特点。

图5 不同材质的基底材料（1-氟化钙；2-氟化钡；3-蓝宝石；4-石英；5-载玻片；6-培养皿）

图6 激发光为532 nm下采集的不同材质基底的拉曼光谱

2.3 基底材料的发光信号的影响

当把激光调整至785 nm后，重新对上述六种基底材料进行检测，结果如图7所示。从图7中发现，蓝宝石、培养皿和石英玻璃依旧有明显的背景干扰，且出峰位置与532 nm激光激发出的谱峰位置一致，说明该信号确为拉曼散射信号。同时氟化钡依然保持与532 nm激光条件下相同的结果，均无明显的拉曼散射信号。但观察载玻片和氟化钙的信号时，发现这两种材料的信号与532 nm激光激发的信号有明显差别，说明785 nm下出现的信号不是拉曼散射信号。为了进一步验证这个假设，将激发光重新调整至532 nm，检测范围设置为534～1 000 nm，用于检测材料的发光光谱。图8是上述六种材料的发射光谱，其中蓝宝石基底自600～1 000 nm有巨大的发光峰，该发光峰为蓝宝石的本征发射峰；载玻片于880 nm处有明显的发射信号，该信号为氧空穴的发射峰，经过式（1）的计算

式中：Raman shift—— 拉曼散射光，波数；

λ1—— 激发光波长，nm；

λ2—— 散射光波长，nm

发现与785 nm激光检测的拉曼光谱在1 380 cm-1处的峰一致；氟化钙于862 nm、869 nm、877 nm和921 nm有两组非常尖锐的发射信号，信号为氟化钙的本征发射信号，同样经过式（1）的计算，同样与785 nm激光激发的拉曼光谱的1 141 cm-1、1 237 cm-1、1 348 cm-1和1 875 cm-1处的峰一致；培养皿在激发光的波长附近有尖锐的信号，其为聚丙烯的拉曼散射信号；石英玻璃除了在534～580 nm之间有拉曼散射外，只有在700 nm和880 nm附近有两个较弱且较宽的发光信号；而氟化钡在整个检测范围内，除激发光波长附近（236 cm-1）有一个明显的尖锐信号外，再无其他明显信号。从上述结果可以看到，蓝宝石、玻璃与氟化钙的发光信号已经影响到长波长激光（785 nm）作激发光下的拉曼光谱信号，而785 nm或更长波长的激发光是拉曼光谱用于生物检测首选，说明蓝宝石、玻璃、石英与氟化钙的发射光谱会对生物样品拉曼光谱的检测结果有不同程度的干扰。而氟化钡因其在540～1 000 nm的范围没有任何发射光谱，使其成为一种优良的生物样品拉曼光谱检测承载基底。

图7 激发光为785 nm下不同材质基底的拉曼光谱

图8 不同材质基底的发光光谱

最后，为了验证上述六种基底用作生物样品承载基底的背景影响，癌细胞分别被分散及固定在这几种基底的表面，并使用相同条件对癌细胞进行检测，结果如图9所示，其中癌细胞的数据是由承载于载玻片上的细胞数据扣除载玻片背景基底数据所得到的。从图9中可以看出，因为细胞含水量高且密度低，故其信号极微弱，所以处于不同承载基底上的细胞信号均是承载基底本身的信号，同时从结果中也可以看出，在关键的400～1 800 cm-1的生物样品信号区，氟化钡承载基底上的背景信号确实影响最小，从而证明氟化钡在这六种承载基底中是最优良的生物样品承载基底。

3 基底选择方法

通过上述分析，发现这六种材料中，氟化钡是最好的承载材料，具有拉曼信号干扰范围小，无明显发射光谱等优点，最适用于作为生物样品的承载。从分析的过程中，可以探究承载基底的选择标准：1）承载基底材料的拉曼散射信号微弱或信号范围小；2）承载基底材料的发射光谱在被拉曼光谱检测范围内无明显发光信号。

图9 扣除背景的癌细胞及不同基底上的癌细胞的拉曼光谱

4 结语

本文对六种拉曼光谱生物样品承载基底材料进行了考察，分别发现培养皿（聚丙烯）具有丰富且范围宽的拉曼散射信号，石英玻璃（晶体二氧化硅）的拉曼光谱信号在低波数有明显的干扰，蓝宝石（三氧化二铝）、载玻片（钠钙玻璃）和氟化钙有明显的发光光谱信号，只有氟化钡既无宽范围的拉曼光谱信号，也无明显的发光光谱信号。通过上述考察过程，可以明确拉曼光谱生物样品承载基底的选择标准为：1）该基底材料的拉曼散射信号必须微弱或信号不影响生物材料的信号区域，以避免潜在的背景干扰；2）基底材料在具备微弱拉曼散射信号的同时，不应有明显的发光特性，特别是发光信号不能落在拉曼光谱的检测范围内。上述选择标准的确立，能够为拉曼光谱在日益增多的生物类材料的分析检测中起到实验指导作用，从而提升生物样品的定性定量检测的准确性，进而促进拉曼光谱更广泛的运用。

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