热孜万古力·赛买提

陈士恩

高丹丹

武中庸

车敏娜

李明生

(西北民族大学，甘肃 兰州 730030)

糖类又称碳水化合物，是生物体维持生命正常活动所需能量的主要来源，分布于自然界[1]。糖类主要是以单糖、双糖、低聚糖和多糖4种形式存在。多糖具有降血糖血脂、抗病毒、抗肿瘤、抗感染、抑菌及美白保湿等多种生物活性[2]。多糖的生物活性与其化学结构密切相关，因此研究多糖的单糖组分对研究其生物活性具有重要意义。目前，测定单糖的方法较多，如毛细管电泳法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]和高效阴离子交换色谱法[6]等，其中高效液相色谱法应用最为广泛[7]。

单糖极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度需要在检测前对其进行衍生，本文介绍并比较几种常用单糖分析的高效液相色谱方法，以期为单糖研究提供一定帮助。

1 样品前处理方法

1.1 柱前衍生

由于糖链没有紫外或者荧光基团，无法用紫外检测器和荧光检测器直接检测，单糖的结构限制了检测模式。折射率检测等相关方法往往不能满足现代的要求关于灵敏度或选择性的痕量水平分析，化学衍生技术是规避这个问题至关重要的工具。所以检测前需要对糖进行衍生化处理，使糖链带上紫外或者荧光基团，极性发生改变，将难分离的几种单糖分开，从而更好地检测出单糖[8-9]。柱前衍生化的优点是能选择反应条件、衍生化的副产物能消除其干扰，不需要特定的仪器，成本低，可以选择多种柱前衍生剂，缺点是产生的副产物可能对色谱分离造成困扰，衍生过程中会引入一些杂质[10]。

柱前衍生法的原理是分析前使分析物与衍生剂反应，反应产物在分析柱上进行分离，实际上分离检测的为衍生产物。目前常用的柱前衍生剂有对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid，PABA)、邻氨基苯甲酸(O-aminobenzoicacid)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)、异氰酸苯酯(ABEE)等。

1.1.1 对氨基苯甲酸衍生法 对氨基苯甲酸是苯甲酸的苯环上的对位被氨基取代后形成的化合物，具有中等毒性。对氨基苯甲酸与单糖反应后产生能够被检测的物质，该方法操作比较简便，灵敏度较高，可以准确、快速地检测出待测样品，但因对氨基苯甲酸具有毒性，应用较少[11]。葡萄糖与对氨基苯甲酸的反应式见图1。

图1 葡萄糖和对氨基苯甲酸的反应示意图Figure 1 Schematic representation of the reaction of glucose and p-aminobenzoic acid

郝桂堂等[12]采用2种检测器分析了9种单糖，并优化衍生条件，比较了荧光检测法和紫外检测法，发现采用优化的衍生条件处理后51 h内，单糖的衍生化产物的峰面积基本不变，测得9种单糖的RSD均<4%，r2>0.997，线性关系良好，但几种单糖分离度不好；梁军等[13]建立了HPLC-FID法检测酸浆多糖中的单糖成分，进行梯度洗脱，几种单糖的分离效果良好，精密度、稳定性、重现性也都良好，用此方法检测单糖，操作简单，灵敏度较高，但是操作步骤比较麻烦；Fang等[14]用HPLC-UV法检测植物细胞壁上的单糖含量，线性关系良好，精密度和准确度较高。

1.1.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 柱前衍生化PMP是目前比较常用的衍生剂，其由苯肼和乙酰乙酸乙酯缩合而成，易溶于甲醇。PMP在碱性条件下与还原糖进行反应，1个糖分子还原端可与2分子 PMP 形成稳定的衍生物，反应结束后可以用酸中和[15]；衍生产物无立体异构体、分离度高、检测限低。PMP对糖链进行标记的条件很温和，唾液酸不丢失，对紫外吸收很强，不容易发生去糖基化现象[16]。

Bai等[17]以PMP作为衍生剂测了单糖与寡糖，回收率为93.13%～102.08%，优点是此衍生可以在温和条件下成功地完成，而不需要高温和长的衍生时间，成本较低，适用于普通实验室检测；李卫燕等[18]建立了柱前衍生化高效液相色谱分析当归酸性多糖中的10种单糖的方法，该检测方法简单、高效、准确、可靠、稳定，适合测定多种单糖，但pH、流动相的比例影响这几种单糖的分离度；王媛媛等[19]建立了PMP柱前衍生化HPLC分析9种多糖中单糖的成分，对色谱条件进行优化，筛选出最优的色谱条件，对9种单糖进行分离，分离效果良好，r2>0.999，此方法在分析多种单糖中具有显著的优势，弥补了示差折光检测器和蒸发光散射检测器灵敏度较低的不足；汪名春等[20]分析了莴苣茎水溶性多糖中的8种单糖，其中半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖是主要成分，摩尔比为22.60∶30.42∶17.88，并进行了免疫调节活性试验，发现多糖具有免疫调节活性；宋叶涵等[21]用气相色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法分析了鲍鱼生殖腺多糖的组成，并进行比较，结果表明高效液相色谱法灵敏度较高，分离效果最好，弥补了气相色谱法和薄层色谱法分析单糖的缺点；段月等[22]检测了不同生长期的枸杞多糖中单糖的组成，不同生长期单糖的成分有些差异，其中半乳糖醛酸的含量最高，该方法有效地分离出了几种单糖，但分离时间较长。PMP与葡萄糖的反应式见图2。

1.1.3 邻氨基苯甲酸衍生法 由于邻氨基苯甲酸具有毒性和刺激性，对环境和人体具有一定的危害，因此其应用较少。国外学者经常以邻氨基苯甲酸作为单糖的衍生试剂。此试剂具有简单、易得和灵敏度高的特点[23]。半乳糖与邻氨基苯甲酸的反应式见图3。

图2 PMP与葡萄糖的衍生化反应Figure 2 Derivation of PMP and glucose

图3 半乳糖与邻氨基苯甲酸的衍生化反应Figure 3 Derivatization of galactose and O-aminobenzoic acid

程宾等[24]以邻氨基苯甲酸作为衍生剂，用高效液相色谱法检测重组人促卵泡激素中的单糖，采用酸水解的方法将各糖分离，邻氨基苯甲酸衍生化，用荧光法检测，结果表明，精密度试验中4种单糖的峰面积RSD分别为0.96%，1.00%，0.83%，0.40%，稳定性试验中4种单糖的峰面积RSD分别为1.80%，0.83%，0.18%，1.70%，加样回收率为98%～104%，此方法重复性和回收率高。但是对流动相的要求比较高，由于衍生剂有毒性，使用范围较窄，衍生过程中需要严格操作。

1.2 柱后衍生法

柱后衍生化是分离物在分析柱中分离后在衍生池内与衍生剂发生反应，在检测处检测衍生产物，在柱子内分离出来的是目的物。目前关于柱后衍生高效液相色谱检测单糖的文献不多。赵鑫等[25]采用柱后衍生的方法，用高效液相色谱荧光法检测了4种单糖。结果表明D-葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、山梨醇4种单糖的检出限分别为46.880，1.381，3.856，0.921 μg/mL。测定的饮料和蜂蜜样品的回收率分别为88%～96%，78%～103%，相对标准偏差(RSD)均低于3% (n=6)。此方法具有较高的灵敏度，但因1-萘硼酸具有毒性且衍生方法比较复杂限制了其应用范围。

柱前衍生成本低，但是衍生过程中会引入一些杂质，影响色谱分离，试验结果有一定的误差。柱后衍生法的优点是副产物的产生不会影响试验结果，不需要高的稳定性，缺点是需要额外的设备，成本高，反应条件有限。柱前衍生法与柱后衍生法的不同点见表1。

对PMP、p-AMBA、O-aminobenzoic acid 3种衍生剂的反应条件进行了总结，见表2。

由表1、2可知，柱前衍生相对于柱后衍生简单，但是柱前衍生在衍生过程中会带入杂质，产生误差。柱后衍生法需要的成本较高。衍生剂中PMP是最理想的衍生剂，没有毒性，比较安全。

2 液相色谱检测在单糖分析中的应用

2.1 液相色谱示差折光检测法

示差折光检测器是根据流通池内的化合物折射率不同的原理而对样品进行检测。此法是中国测定单糖的现行国家标准方法 (标准号：GB 5009.8—2016)。示差折光检测器是一种高度稳定的通用性检测器[26]，凡是与流动相折光率不同的样品组分都有响应，因此检测前无需要衍生处理，简化了操作，提高了效率且能有效分离各种组分，使用范围也更广泛[27]。但该方法易受温度、流动相及流速等因素的影响，不可梯度洗脱，灵敏度低[28]。

刘泰然等[29]用高效液相色谱-示差折光检测法检测了保健品中的低聚木糖，被检样品浓度为0.30～4.50 mg/mL，浓度与峰面积线性关系良好，精密度、精确度高且排除了干扰试验结果的因素，但加标回收率较低。于雷等[30]建立了同时检测怀地黄中反相液相色谱示差折光检测法，并优化了检测条件，比较了鲜地黄与生地黄中糖类成分和不同品种不同产地的地黄中单糖和低聚糖含量，结果表明鲜地黄和生地黄中糖类的分布情况有所差异，品种因素和环境因素对地黄中糖类含量有所影响，该方法不需要对单糖进行柱前衍生且分离效果良好；欧阳华学等[31]用液相色谱示差折光检测法同时检测了枸杞中3种单糖和2种低聚木糖，测得这几种糖浓度为10.0～400.0 mg/L，与峰面积有良好的线性关系，相对标准偏差均在5%以下，加标回收率为92.27%～101.93%，但此方法中流动相的比例对试验结果有一定的影响，需要进行优化；刘潇潇等[32]建立了参芪扶正注射液中葡萄糖、果糖和蔗糖的检测方法，优化色谱条件，流速为1 mL/min，温度为40 ℃，在该条件下，这几种糖的分离效果较好，精密度、稳定性、回收率良好，但此方法中柱子温度超过室温，不好控制，而且温度太高容易出现基线漂移的现象；郑秀春等[33]采用莱茵-埃农氏法和高效液相色谱-示差折光检测法检测了奶粉中乳糖和蔗糖，结果表明HPLC-RID法较为准确，分析时间短，回收率高，但示差折光检测器对温度比较敏感，影响试验结果；张建杰等[34]采用液相色谱示差折光检测法检测了水产品中的几种糖，核糖、葡萄糖、果糖等分离效果良好，这几个单糖的回收率在70.2%～98.5%，此方法不需要衍生，简单，分离效果好，但是加标回收率较低，出现倒峰。

表1 柱前衍生与柱后衍生比较Table 1 Comparison of pre-column derivatization and post-column derivatization

表2 3种衍生剂的特点比较Table 2 Comparison of the characteristics of 3 derivatives

2.2 液相色谱蒸发光散射检测法

蒸发光散射检测器是通用型检测器之一，是示差折光检测器的升级。蒸发光散射检测器的原理为：检测器中高速氮气将待测物喷成雾状液滴，流动相挥发后形成微小颗粒，载气把这些颗粒带到检测器的散射室，从而检测出散射光的强度[35]。液相色谱蒸发光散射检测法不仅弥补了示差折光检测法不能梯度洗脱等不足之处，也弥补了紫外检测不能检测无紫外吸收或只有紫外末端吸收物质的缺陷[36]。该方法可以进行梯度洗脱，同时也消除了流动相及温度变化带来的基线漂移问题，而且具有较高的灵敏度、重现性和稳定性；但不能使用非挥发性缓冲盐作为流动相且较高的检测成本也制约其应用范围[37-38]。

Ding H等[39]用高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时检测了食品中的13种糖，测得这13种糖的检出限为0.1～5.0 g/mL，加标回收率为96.1%～105.2%，相对偏差较低，此方法高效、简单、准确，为HPLC-ELSD提供了良好的试验基础和方法；沈少林等[40]检测了10种蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量，对色谱条件和检测器参数进行优化，发现2种单糖的检出限为10 mg/L，是示差折光检测法高10倍以上，弥补了示差折光检测法的缺点；尚姝等[41]建立了HPLC-ELSD法检测保健食品中的几种单糖和双糖的方法，检测时发现这几种糖的分离度都大于2.0，比较适合检测多种单糖，但是对温度比较敏感，需要严格控制；刘倩等[42]用HPLC-ELSD法分离和定量检测了啤酒中的糖类化合物，两种单糖浓度为0.05～5.00 g/L，它验证该方法的回收率为94～98.4%，果糖和葡萄糖的RSD分别为2.78～2.89%，3.02～3.11%，此方法不需要衍生处理，简单、准确，适合测定啤酒中的单糖，但检测过程中出现了杂峰。

蒸发光散射检测器(HLSD)相对于示差折光检测器(RID)灵敏度高，不受其他因素的影响，这2种检测器的优缺点比较见表3。

表3 ELSD与RID的比较Table 3 Comparison of ELSD and RID

2.3 质谱法

近年来，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)已经成为一种适用于大量分析微量有机混合物的创新分析技术。与气相色谱-质谱(GC-MS)的“传统”技术相比，LC-MS/MS更易于使用，适用于相当多的相关分析物。液相色谱-质谱法在检测单糖过程中也广泛使用。天然糖由于具有高亲水性不能保留在烷基键合硅胶柱如C18上，因此它们的分离不可能使用反相液相色谱。在另一方面，已经提出了各种色谱方法来分离糖类和寡糖，包括配体交换层析[43]、尺寸排阻层析[44]，以及在二氧化硅基粘合极性固定相上广泛使用的亲水色谱法[45]。未衍生碳水化合物的分离需要特定类型的色谱柱，如烷基化硅胶[46]或各种离子交换媒体[47]，其中特定的抗衡离子的添加影响分离。但是，大多数都有问题，尤其是在柱稳定性，寿命和分离重现性方面。因此，在此工作中使用UPLC酰胺BEH柱分离单糖和寡糖而无需预先衍生化。Ayman A等[48]用此方法检测了单糖和二糖，使用乙腈-水在BEH酰胺柱上进行梯度洗脱，使用选择离子记录(SIR)采集模式进行采集检测，检出限分别为0.25，0.69，0.82，3.58 lg mL-1，有良好的线性关系。该方法比较快速，对pH不敏感，有良好的效率和重现性，能分离各种各样的高度极性化合物，但仪器成本高，对试剂的要求也很高。

3 展望

近年来，高效液相色谱法在单糖的分析中使用比较广泛，结合国内外现状看，单糖的分析情况与未来研究方向是：

(1) 直接检测法中液相色谱示差折光检测法是通用性的检测器，但是灵敏度较低、不能梯度洗脱；液相色谱蒸发光散射检测法无需衍生，灵敏度较高。这2种方法分离度较差，提高分离度是以后研究的方向。

(2) 柱前衍生中，对氨基苯甲酸和邻氨基苯甲酸是有毒的衍生剂，其中PMP柱前衍生化使用范围最广泛且无毒，但是柱前衍生过程中衍生剂的添加，会引入一些杂质，对试验结果会造成误差，怎样减少误差是要解决的问题之一。

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