刘存芳

吴 睿

赵 桦

田光辉

(陕西理工大学陕西省催化基础与应用重点实验室,陕西 汉中 723000)

野菊(ChrysanthemumindicumL.)又称为苦薏、野黄菊、路边黄等，是菊科的一种多年生草本植物，广泛分布于中国西南、华南、华中、华北及东北各地，秦岭山地和大巴山区盛产野菊[1]。野菊花是野菊的头状花序，能治疗风热感冒、咽喉肿痛等病症[2-4]，野菊花中含有萜类和挥发油[5-6]、多糖和糖苷[7]、氨基酸和蛋白质、黄酮[8]、黄色素以及营养元素等成分[9-10]，其中野菊花的质量检验是以蒙花苷含量作为指标[11]，已将野菊花应用于药品、食品、化妆品、保健品等行业。在收集和加工野菊花的过程中会有大量的野菊茎叶产生，这些野菊茎叶中含有和野菊花相同的活性成分[12]，其茎叶的开发利用研究还较少[13]，野菊茎叶中多糖的研究更少[14]。有对野菊同属植物茎叶中多糖提取的文献报道[15]，其多糖提取方法有热水浸提法、稀碱溶液加热提取法、纤维素酶辅助提取法、超声辅助提取法、水浴回流提取法等，热水浸提和水浴回流一般需要2 h或更长时间，超声辅助提取也需要0.5 h以上，而已用于植物多糖的微波提取只需要10～20 min，微波提取有加热均匀、用时少、节省溶剂、耗能低等特点，且微波辅助提取野菊多糖的研究报道尚少。用微波辅助法提取野菊茎叶多糖可克服提取时间长、加热不均匀的缺陷，对微波辅助提取野菊茎叶多糖的工艺进行优化，探索工业化生产的提取技术。

本研究拟借助微波辅助法提取野菊茎叶中的多糖，以多糖的提取量为评价指标，设计正交试验优化多糖的提取工艺，通过DEAE-纤维素柱分离纯化多糖，并测试野菊茎叶多糖的抗氧化活性，旨在为野菊茎叶的综合利用以及野菊茎叶多糖的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

野菊的茎叶：在2015年10月下旬收集于秦巴山区，由陕西理工大学省级植物学学科负责人赵桦教授鉴定，确定是菊科菊属植物野菊(ChrysanthemumindicumL.)的茎叶。摘除野菊茎叶上的杂草腐叶，置于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎过200目筛，密封备用；

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、乙醚、无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、VC、硫酸亚铁、邻二氮菲、磷酸等：分析纯，西安化学试剂厂；

水：二次蒸馏水，自制；

质量百分比6%苯酚溶液和0.01%过氧化氢溶液、0.75 mmol 邻二氮菲溶液、0.75 mmol硫酸亚铁溶液、PBS溶液为pH=7.4的磷酸缓冲溶液、DPPH溶液为0.1 mmol/mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼的乙醇溶液：临时配制。

1.1.2 主要仪器设备

紫外-可见分光光度计：UV-6300PC型，上海美谱达仪器有限公司；

SINEO萃取仪：UWave-1000型，上海新仪微波化学科技有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB-III型，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发器：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

索氏提取器：50～500 mL，天津市世博伟业化玻仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖标准曲线的制作 苯酚-硫酸法测定多糖的提取量[16]，以葡萄糖作为基准制作标准曲线。准确称取10.000 mg葡萄糖定容于10 mL容量瓶中配成1 mg/mL的葡萄糖溶液。精确移取葡萄糖溶液和水于8支10 mL的具塞比色管，用水补足2 mL，配成浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/mL的溶液，再精确加入3 mL苯酚溶液和5 mL浓硫酸，摇匀，80 ℃水浴保温20 min，取出冷却至室温，以水为空白，在490 nm波长处逐个检测吸光度(y)值。

1.2.2 野菊茎叶多糖的提取及提取量的测定 准确称取0.6 g 野菊茎叶粉末于小型索氏提取器的滤纸桶里，水浴加热乙醚抽提至无色[17]，再换用乙醇抽提至无色。将野菊茎叶粉末取出，晾干后放进塑料提取管内，加适量水，用微波辅助在不同料液比、提取温度、提取时间、微波功率等条件下提取野菊茎叶中的多糖，抽滤，野菊茎叶滤渣用相同方法再提取1次，将2次提取液转移到100 mL容量瓶中，洗涤，定容，移取2 mL溶液于具塞比色管中，加入3 mL 苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，摇匀，80 ℃水浴保温20 min，取出冷却至室温，在490 nm波长处测定吸光度，依据标准曲线确定野菊茎叶多糖的提取量。

1.2.3 野菊茎叶多糖提取的单因素试验及正交试验优化

(1) 料液比：在提取温度80 ℃，提取时间10 min，微波功率450 W，料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)的条件下，测定野菊茎叶多糖的提取量。

(2) 提取温度：在料液比1∶40 (g/mL)，提取时间10 min，微波功率450 W，提取温度分别为50，60，70，80，90，100 ℃的条件下，测定野菊茎叶多糖的提取量。

(3) 提取时间：在料液比1∶40 (g/mL)，提取温度80 ℃，微波功率450 W，提取时间分别为4，6，8，10，12，14 min 的条件下，测定野菊茎叶多糖的提取量。

(4) 微波功率：在料液比1∶40 (g/mL)，提取温度80 ℃，提取时间10 min，微波功率分别为300，350，400，450，500，550 W的条件下，测定野菊茎叶多糖的提取量。

(5) 正交试验：在单因素试验的基础上以料液比、提取温度、提取时间、微波功率为试验因素，以野菊茎叶多糖的提取量为评价指标，设计L9(34)正交试验优化野菊茎叶多糖的微波辅助法提取工艺条件。

1.2.4 野菊茎叶多糖的提取和纯化 称取100 g野菊茎叶粉末放入常量索氏提取器中依次用乙醚和乙醇抽提至提取液呈无色。取出野菊茎叶粉末，晾干，在最佳提取工艺下提取多糖，抽滤，将粉末用水再提取1次，合并提取液。将提取液减压浓缩蒸出总体积2/3的水，并加入5倍体积的乙醇，静置24 h，抽滤，滤饼干燥，得粗多糖。平行提取5次，合并粗多糖，用水-乙醇重结晶，再经Sevag 法用正丁醇和氯仿脱蛋白，浓缩，通过DEAE-纤维素柱(5.0 cm×120.0 cm)依次用水和0.1 mol/L的氯化钠溶液进行洗脱分离，流速为2 mL/min，每管10 mL，苯酚-硫酸法检测，减压浓缩收集液。合并氯化钠溶液洗脱的糖液，乙醇沉淀过夜，抽滤，置于105 ℃ 干燥箱中干燥至恒重，得到野菊茎叶精制多糖。

1.2.5 野菊茎叶多糖的抗氧化活性

(1) 对·OH清除作用：通过Fenton体系中对Fe2+/H2O2产生的·OH清除率来确定。称取2.5 mg 野菊茎叶精制多糖定容于25 mL容量瓶中，得浓度为0.1 mg/mL的多糖溶液，取8支10 mL具塞比色管，其中6支编号为1～6号，依次加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL多糖溶液；另2支标记为未损伤管和损伤管，不加多糖溶液。分别向8支具塞比色管中加入1 mL邻二氮菲溶液、1.5 mL PBS 溶液和1 mL 亚硫酸铁溶液，摇匀，再向1～6号以及损伤管中移取1 mL 过氧化氢溶液，将8支比色管用水滴加至刻度线，摇匀，放置于培养箱内37 ℃下保温2 h，取出冷却至室温，在510 nm下测量吸光度(I)值。同时，以相同浓度的VC作为对照。试验重复3次，取平均值。按式(1)计算·OH的清除率。

(1)

式中：

A——清除率，%；

In——加多糖溶液或VC溶液的吸光度；

I1——未损伤管溶液的吸光度；

I0——损伤管溶液的吸光度。

(2) 对DPPH·清除作用：准确称取野菊茎叶精制多糖分别置于6个5 mL的容量瓶中，配成浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL多糖溶液；再取6个5 mL的容量瓶，称取VC，配成和多糖溶液浓度相同的VC溶液。分别移取2 mL不同浓度的多糖溶液于6支5 mL具塞比色管中，再分别加入2 mL DPPH溶液，混匀，避光室温放置30 min，在517 nm波长处测定吸光度，记作A1；用水取代多糖溶液重复试验，在同样波长处测定吸光度，记作A0；以水取代DPPH溶液作为空白，在517 nm波长处测定吸光度，记作A2。相同浓度的VC作为对照代替多糖溶液重复试验。按式(2)计算DPPH·的清除率。

(2)

式中：

B——清除率，%；

A0——水和DPPH溶液的吸光度；

A1——不同浓度的多糖溶液和DPPH溶液反应后的吸光度；

A2——不同浓度的多糖溶液和水的吸光度。

2 结果与分析

2.1 糖标准曲线

以葡萄糖的质量浓度(x)为横坐标，吸光度(y)值为纵坐标，绘制的糖标准曲线见图1，得回归方程：y=15.038x+0.065 2，R2=0.998 3，可见在0.02～0.16 mg/mL的范围内，质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 Glucose stangdard curve

2.2 提取野菊茎叶多糖的单因素试验

2.2.1 料液比对野菊茎叶多糖提取的影响 由图2可知，在1∶10～1∶50 (g/mL)时随着料液比值的减小野菊茎叶多糖提取量持续增大；料液比在1∶50 (g/mL)之后提取量减小，可能是溶剂量增大会导致微波作用于野菊茎叶组织的能量减小，不利于多糖溶出。料液比在1∶40～1∶50 (g/mL)时提取量没有显著性差异，故选取料液比1∶40 (g/mL)。

2.2.2 提取温度对野菊茎叶多糖提取的影响 由图3可知，在50～80 ℃时野菊茎叶多糖提取量持续升高；当温度超过80 ℃后，野菊茎叶多糖提取量逐渐下降，可能是持续的高温和微波处理会使野菊茎叶多糖发生分解，使提取量减小。因此选择提取温度80 ℃。

图2 料液比对多糖提取量的影响Figure 2 Effects of solid-liquid ratio on the polysaccharide extraction content

图3 提取温度对多糖提取量的影响Figure 3 Effects of extraction temperature on the polysaccharide extraction content

2.2.3 提取时间对野菊茎叶多糖提取的影响 由图4可知，在4～8 min时野菊茎叶多糖提取量持续递增；8 min后开始下降，可能是较长时间的微波处理使部分多糖链断裂造成损失，使多糖提取量减小。因此选择提取时间8 min。

2.2.4 微波功率对野菊茎叶多糖提取的影响 由图5可知，在300～450 W时野菊茎叶多糖提取量随着微波功率的增大而增大；微波功率达到450 W之后，其多糖提取量呈现出下降趋势，可能是较大的微波功率会破坏多糖结构促使多糖分解。因此选择微波功率450 W。

2.3 正交试验优化野菊茎叶多糖的提取工艺

在单因素试验的基础上，每个因素取3个水平(表1)，以野菊茎叶多糖提取量为评价指标，设计正交试验来优化野菊茎叶多糖的提取工艺，结果见表2。由表2可知，影响野菊茎叶多糖提取的因素主次为：微波功率>提取温度>提取时间>料液比，最佳提取工艺条件为料液比1∶40 (g/mL)、提取温度80 ℃、提取时间10 min、微波功率450 W。

图4 提取时间对多糖提取量的影响Figure 4 Effects of extraction time on the polysaccharide extraction content

图5 微波功率对多糖提取量的影响Figure 5 Effects of microwave power on the polysaccharide extraction content

验证实验平行进行3次，在最佳提取工艺条件下野菊茎叶多糖提取量高达6.32%，而且提取过程中温度不高，料液比适中，能快速进行多糖的提取，该工艺条件适合工业化生产。

2.4 野菊茎叶多糖的抗氧化活性

2.4.1 对·OH的清除作用 由图6可知，野菊茎叶多糖对Fe2+/H2O2产生的·OH有清除作用，且随其多糖浓度的增大对·OH的清除率不断提高，二者之间存在着一定的量效关系。和VC比较，野菊茎叶多糖对·OH的清除率整体偏低，但也表现出明显的清除效果，说明其多糖能清除·OH，有抗氧化活性。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor and level graph

表2 正交试验结果Table 2 Date and analysis of orthogonaltext

图6 野菊茎叶多糖对·OH的清除作用Figure 6 Scavenging activity of polysaccharide from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum on ·OH

2.4.2 清除DPPH·的作用 由图7可知，相同浓度下野菊茎叶多糖和Vc对DPPH·的清除作用存在差异，野菊茎叶多糖对DPPH·的清除效果弱于VC，但也反映出对DPPH· 有明显的清除作用，且野菊茎叶多糖浓度和对DPPH·的清除率存在着量效关系。说明野菊茎叶多糖是一种潜在的抗氧化物质。

图7 野菊茎叶多糖对DPPH·的清除作用Figure 7 Scavenging activity of polysaccharide from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum on DPPH·

3 结论

本研究借助微波辅助法提取野菊茎叶中的多糖，以多糖提取量为评价指标，通过单因素及正交试验确定野菊茎叶多糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶40 (g/mL)、提取温度80 ℃、提取时间10 min、微波功率450 W，在该条件下野菊茎叶多糖的提取量高达6.32%。借助微波辅助法能快速提取野菊茎叶中的多糖，可为工业化生产提供技术参数，同时，也为分步提取天然产物中的活性成分提供了思路。本试验证实野菊茎叶多糖具有抗氧化活性，是一种潜在的抗氧化物质。后续将对野菊茎叶多糖的其他生物活性以及构效关系进行进一步的研究。

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