郑婧萱，张舒月，何以宁，薛晓华，郭晓军

（河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071000）

青贮饲料中黄曲霉毒素的污染是一个全球性问题，是青贮饲料中霉菌毒素评定的主要指标［1］，给动物生产性能和人类健康带来巨大的威胁［2］。因此，青贮饲料中黄曲霉毒素的去除是反刍动物养殖者和科研机构重点关注的内容。该研究前期工作筛选到1株颉颃黄曲霉生长并且降解黄曲霉毒素的双功能菌株枯草芽胞杆菌N-1a，在青贮过程中起到良好的脱毒作用。枯草芽胞杆菌所特有的芽胞抗逆性强，能够满足现代工业化的后处理生产要求，且具有十分惊人的休眠能力，普通条件下可保存几年到几十年的生活力［3-4］，延长了其货架期和生物活性，所以现在芽胞杆菌产品的形式大多是以芽胞的形态存在的［5］。

该研究目的在于对菌株N-1a的产芽胞培养基组成和培养条件进行优化，确定其培养基的最佳组成配比及发酵条件，提高活菌数及芽胞形成率，从而为工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株：黄曲霉毒素降解菌株枯草芽胞杆菌N-1a，保存于河北农业大学制药工程实验室。

1.1.2 培养基：NA培养基、种子培养基、发酵培养基和产芽胞优化培养基参照郭晓军等［6］的方法配制。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化：取4℃N-1a菌株斜面在NA平板上进行划线，挑取目的菌株单菌落接种到NA斜面上37℃培养12 h后备用。

1.2.2 菌株的种子培养：将活化后的菌株接种于50 mL种子培养基，37℃、200 r/min摇床培养12 h。

1.2.3 菌株的发酵培养：按照6.0%的接种量将种子液接种于发酵培养基中，37℃、200 r/min摇床培养48 h，进行活菌计数和芽胞形成率的检测。

1.2.4 单因素试验：通过摸索发酵培养基的不同碳源、氮源、无机盐对活菌数和芽胞形成率的影响，确定培养基最佳碳源、氮源和无机盐。

1.2.5 正交试验：根据单因素试验结果配制不同浓度的培养基，按正交试验表L9（34）设计4因素3水平试验，摇床培养48 h。通过测定活菌总数和芽胞形成率确定最优培养基的配比。

在确定最适培养基的基础上，对培养基pH值、接种量、装液量、发酵时间按正交试验表L9（34）设计4因素3水平试验进行发酵条件优化。

1.2.6 测定方法：采用血球计数板法测定活菌总数［7］；参照杨继业等［8］方法进行芽胞形成率的测定。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对菌株芽胞产量的影响

由表1可见，当以玉米粉作为碳源时，活菌总数为3.82×108cfu/mL，芽胞形成率达到了86.13%，芽胞产量最高，因此选择玉米粉作为培养基的最佳碳源。

表2 不同氮源对芽胞产量的影响

表3 不同无机盐对芽胞产量的影响

2.2 不同氮源对菌株芽胞产量的影响

由表2可见，当以黄豆饼粉作为氮源时，活菌总数达11.7×108cfu/mL，芽胞形成率达到最大，为84.02%，芽胞产量最高，因此，选择黄豆饼粉作为培养基的最佳氮源。

2.3 不同无机盐对菌株芽胞产量的影响

无机盐对菌体的生长和芽胞的形成均有较大影响，Mg2+的加入能促进芽胞产生，芽胞产量达到2.41×108cfu/mL，活菌总数和芽胞形成率分别为2.93×108cfu/mL和 82.25%。 不少研究证明，Mn2+是菌体生长和芽胞形成的微量元素，也是许多酶的辅助因子。由表3可知，当以Mn2+为无机盐时，该菌株产芽胞能力也较强，芽胞产量达1.94×108cfu/mL，活菌总数和芽胞形成率分别为2.33×108cfu/mL和83.26%，因此，选择 MgSO4·5H2O 和 MnSO4·H2O 作为培养基的最佳无机盐。

2.4 培养基配比正交试验结果

将最佳碳源、氮源和无机盐按照不同浓度进行四因素三水平的正交试验，试验结果见表4。试验结果表明，对芽胞产量影响的主次因素为：MnSO4·H2O>黄豆饼粉>玉米粉>MgSO4·5H2O。 试验中最佳组合为A2B2C3D1，其中活菌数为4.10×108cfu/mL，芽胞形成率达到83.52%，芽胞产量为3.42×108cfu/mL，与正交优化表中最优组合相同，所以确定最优培养基组成配比为玉米粉2.0%、黄豆 饼 粉 1.0% 、MnSO4·H2O 0.10% 、MgSO4·5H2O 0.01%。

2.5 培养条件正交试验结果

表4 N-1a菌株培养基组成正交试验结果

表5 N-1a菌株培养条件正交试验结果

由试验结果（见表5）可知，对芽胞产量影响的主次因素为：发酵时间>接种量>pH值>装液量。试验组中最佳组合为A2B1C2D3，其活菌总数为6.42×108cfu/mL、芽胞形成率为80.53%、芽胞产量为5.17×108cfu/mL。该结果与正交优化表中最优组合A2B1C2D2不一致，因此，需做验证试验。由验证试验（见表6）结果知，组合A2B1C2D2芽胞形成率、活菌总数和芽胞产量均优于组合A2B1C2D3，分别为 81.25%、6.08×108cfu/mL、4.94×108cfu/mL。 所以确定最佳发酵条件为：发酵时间48 h、接种量4%、pH值7.0、装液量75 mL/250 mL。

表6 验证试验

3 讨论

芽胞是产芽胞细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分，它的形成受营养物质和环境因素的影响。该试验结果表明，不同的碳源、氮源、无机盐及其配比均可以作为影响芽胞形成率的底物。不同的菌株最适培养基成分也不尽相同，培养基成分的组成对不同菌株芽胞形成率的影响的主次顺序也不同。但值得一提的是，研究无机盐对该菌株的影响时，Mn2+的存在的确提升了菌株的芽胞形成率，这与陈秋红等［9］人的相关研究大致相同。正交试验的优化仅仅是对前人考察最多的影响因素进行研究得到了芽胞产量的最优组合，为了使黄曲霉毒素降解菌株在青贮及发酵饲料中发挥更好的作用，需要进一步在中试发酵罐的基础上对影响芽胞形成的因素进行研究，为黄曲霉毒素降解菌株的产品推广应用奠定基础。

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［1］孟庆翔，杨军香.全株玉米青贮制作与质量评价［M］.北京：中国农业科学技术出版社，2016.

［2］王丽芳，杨健，姚一萍，等.影响生鲜乳质量安全的风险因子——霉菌毒素 ［J］.畜牧与饲料科学，2017，38（9）：41-43.

［3］郝庆红，郭云霞，刘月琴，等.鸡源抗腹泻芽胞益生菌JM-35摇瓶发酵产芽胞条件优化［J］.河北农业大学学报，2013，36（2）：103-107.

［4］吴逸飞，赵旭民，黄小晖，等.凝结芽胞杆菌产芽胞培养基及培养条件优化［J］.饲料工业，2013，34（23）：22-24.

［5］杨立华，赵述淼，冷一非，等.一株凝结芽胞杆菌产芽胞条件的研究［J］.中国酿造，2010（5）：96-98.

［6］郭晓军，郭威，杨继业，等.堆肥用产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及产芽胞条件优化 ［J］.黑龙江畜牧兽医，2017（16）：61-64，293.

［7］程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术［M］.2版.北京：科学出版社，2012.

［8］杨继业，郭晓军，郭威，等.产有机酸芽胞杆菌的筛选、鉴定及产芽胞条件优化 ［J］. 饲料工业，2015，36（4）：44-51.

［9］陈秋红，孙梅，匡群，等.培养条件对凝结芽胞杆菌芽胞形成的影响［J］.生物技术，2009，19（1）：77-81.