李洋，朴颖，类延娜，成宪武，李香

组织蛋白酶S（cathepsins S，CatS）是一类蛋白水解酶，它们广泛地分布在人体各种细胞的溶酶体中，主要参与细胞溶酶体内蛋白质再利用[1]。目前为止，在人体组织及细胞发现了11种组织蛋白酶。其家族中，研究表明，CatS是一种在细胞内、外都具有很强生物活性（如胶原，弹性蛋白等分解活性）的半胱氨酸蛋白酶。2012年，Circulation杂志发表的文章阐明了组织蛋白酶通过细胞外基质分解及在心血管细胞和炎症-免疫细胞生物行为中，促进各种心血管疾病的发生、发展[2]。过氧化物酶增殖物激活受体（peroxidase proliferation activated receptors ，PPAR）是核受体超家族成员。PPAR 包括 PPAR-α、PPAR-β/δ 和 PPAR-γ三种表型[3]。由于PPAR 参与调控机体众多病理生理过程，以此为靶点，开发和利用它们的高选择性激动剂具有重要的科学意义及广阔的应用前景。目前较多的研究集中于CatS在动脉硬化性心血管疾病中的表达及其作用，而CatS在缺血性血管生成中表达及其作用鲜有报道[4]。本研究旨在观察CatS抑制剂（CatS-I）影响小鼠缺血诱导的血管新生机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源与分组

将8周龄、体重21～25 g的野生型小鼠（C57/BL6，由日本名古屋大学动物实验室提供）按照随机数字表法分为两组：对照组和CatS-I组，每组各20只。对照组采用基础饲料饲养基础上再注射5%羧甲基纤维素钠盐（CMC），每天1次，腹腔注射，共17天；CatS-I组在基础饲料饲养基础上再注射CatS-I[1 mg/（kg·d）]，每天 1次，腹腔注射，共17天。两组腹腔注射3天后建立下肢缺血模型。分别测定术前、术后即刻、4天、7天、14天的下肢血流；术后第4天利用蛋白免疫印迹（Western）杂交技术检测PPAR-γ、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化内皮一氧化氮合酶（p-eNOS）和血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factor, VEGF）等蛋白表达水平；术后第7天，取缺血骨骼肌制作冰冻切片，采用免疫组织化学方法测定毛细血管密度。

1.2 试剂

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）购自于美国Cell signaling Technology 公司；p-Akt 购自于美国 Cell signaling Technology公司；蛋白激酶B（Akt）购自于美国Santa Cruz Biotechnology公司；p-eNOS （Ser1177）购自于美国BD Biosciences公司；eNOS购自于美国BD Biosciences公司；PPAR-γ购自于美国Abcam公司；CD31 单克隆抗体购自于美国 Santa Cruz 公司。

1.3 小鼠单侧下肢缺血模型的建立

小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）进行麻醉，麻醉后进行脱毛，采取仰卧位固定，切开小鼠左侧下腹部皮肤后，首先分离股神经后结扎股动脉根部，剥离股动脉三个主要分支并结扎，然后切除股动脉主干及其分支，建立下肢缺血模型。

1.4 蛋白免疫印迹法检测蛋白水平

用蛋白裂解液提取细胞或组织总蛋白，按试剂盒说明进行，测提取液的蛋白质水平。通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳、转膜、杂交、显色、分析等步骤检测靶蛋白的表达水平。该实验重复3次。信号通路的检测：检测当日肌肉组织的总蛋白，用BCA定量法检测蛋白含量。取10μg蛋白上样到12.5% SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后电转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭，4℃过夜。分 别 加 入 GAPDH、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS、PPAR-γ。室温孵育1 h， 用TBST缓冲液[TrisHCL（1mmol/L，pH 7.5）：50 ml、Nacl：8 g、KCL：0.2 g、吐温：0.5 ml ，加蒸馏水定容至1 L]摇动洗膜3次 （10 min/次）。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG （美国ROCKLAND公司），室温孵育1 h，用TBST摇动洗膜三次 （10 min/次）。最后进行荧光扫描，应用图像分析系统进行光密度扫描、分析[5]。

1.5 缺血下肢肌肉组织中毛细血管密度的判断和计数

采用激光多普勒血流成像仪（瑞典Lisca Development，Linkoping公司）测量术前、术后不同时间点的缺血侧（左侧下肢）和对侧非缺血侧（右侧下肢）的血流灌注情况。每次测量之前，小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）进行麻醉，麻醉后采取仰卧位，置于37℃条件下15 min。仰卧位扫描之后，存储图像，图像存储形式为整个双下肢区域的二维图像，经过PIMⅡ Patch Test WIZARD软件分析，血流灌注情况用激光多普勒血流平均值表示。用每只小鼠同一时间点的缺血侧与非缺血侧的下肢血流灌注的比值表示同只鼠的缺血下肢血流恢复情况。

下肢肌肉组织行冰冻切片（5 μm），采用CD31单克隆抗体免疫组化染色法标记血管内皮细胞以测定毛细血管数量和密度。取5个肌肉横切面视野，计算每个视野的毛细血管数量，取其平均值。毛细血管密度用每高倍视野（×400）下，毛细血管与肌纤维数量的比值表示[6]。

1.6 免疫组织化学染色

应用免疫组织化学检测试剂盒（丹麦DAKO公司产品）及与增殖相关的CD31单克隆抗体（美国Santacruz/Cell Signaling公司产品）。染色步骤按说明书操作步骤进行。为证明抗体免疫组化检测特异性，实验中应用了免疫动物IgG代替一抗作为阴性对照[5]。

1.7 统计学方法

统计学分析应用SPSS15.0统计软件。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用Tukey post hoc test 进行多重比较。计数资料的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组缺血与非缺血下肢血流的动态变化（图1）

CatS-I组明显抑制下肢血流的恢复。术后即刻、术后1天血流明显下降，术后第4天开始血流逐渐恢复，术后第14天CatS-I组小鼠缺血下肢血流恢复明显慢于对照组（P＜0.05）。

图1 两组的激光多普勒血流成像（1A）和缺血侧与非缺血侧下肢血流灌注的比值统计图（1B）

2.2 利用CD31免疫组织化学染色观察两组骨骼肌毛细血管的形成（图2）

术后第14天， 与对照组比较，CatS-I组的非缺血骨骼肌中毛细血管形成略减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），但缺血骨骼肌中毛细血管形成明显受阻。毛细血管密度统计图（图2B）表明，CatS-I组小鼠的毛细血管密度明显低于对照组（P＜0.01）。

图2 术后第14天两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌中毛细血管密度比较（×400）

2.3 蛋白免疫印迹杂交法检测两组与血管新生有关分子的蛋白水平表达（图3）

PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白的免疫印迹图和表达水平的定量分析结果表明：CatS-I组小鼠中，PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白水平与对照组比较明显减少（P＜0.05）。

图3 蛋白免疫印迹法比较两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌中蛋白表达水平

3 讨论

2004 年，Cheng等[7,8]报道了CatS 在损伤性增生内膜及心力衰竭心肌中表达明显增高，并在心血管重构中起着重要作用。此后，也发现CatS主要在血管平滑肌细胞膜外与ανβ3 整合素结合，调控平滑肌细胞的移动及浸润功能[9]。药物干预CatS 可以抑制动脉斑块形成及改善斑块稳定性[10]。这些研究结果提示，CatS 参与动脉粥样斑块形成、发展、破裂和破裂后修复的全过程。以往的散在报道显示：一方面，CatS通过降解、失活碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）或分解Ⅳ型胶原蛋白产生具有抗血管新生活性的血管抑制素，另一方面，通过修饰以及释放血管生长调节因子控制肿瘤血管新生[11]。许多动物实验及临床研究显示：骨髓和外周血血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell, EPC）细胞移植可以促进缺血性血管新生、改善缺血症状[12]。本研究结果表明：CatS-I明显抑制下肢血流的恢复及毛细血管的形成。揭示：CatS在动脉粥样硬化性血管疾病的发生、发展中发挥着重要的作用，亦可能参与血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和EPC 的功能调控。下肢缺血性疾病最主要的病因为动脉粥样硬化，因此，CatS 可以成为参与缺血性血管新生的关键成员。

研究结果公认:PPAR-γ主要表达在脂肪组织，它介导脂肪细胞分化，并在糖和脂肪酸代谢中发挥调节作用的重要基因。最近，PPAR-γ在心血管系统和炎症-免疫细胞中表达及其作用越来越受到重视。2013 年，Kroller-Schon 等[13]的主要研究成果阐明了PPAR-γ共激活因子（PPAR-γ coactivator-1α， PGC-1α） 具有抵抗血管紧张素诱导的血管损伤和炎症反应。Wolf等[14]发现，PPAR-γ阻滞剂可以抑制Akt的磷酸化，从而通过抑制上述内皮细胞的迁移作用而发挥作用。另有研究表明：PPAR-γ激活通过降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗[15]。随后的研究还证实了PGC-1α通过促进缺氧诱导的VEGF合成，促进EC的血管形成效应[16]。内皮素-1可以减弱在慢性肺动脉高压动物宫内内皮细胞的PPAR-γ通路，且抑制血管新生[14]。另一方面，PPAR-γ 激动剂通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein K inase，MAPK）-PGC-1α-eNOS-NO 通路抗 EC 凋亡[17]。

综上，CatS-I明显抑制下肢血流的恢复及毛细血管的形成，CatS-I组小鼠中，PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白水平与对照组比较明显减少。因此，CatS在缺血性血管新生中的作用可能是CatS通过PPAR-γ激活及PI3K/Akt/eNOS 信号通路调控EPC分化，增殖及血管生成机制。CatS有望成为治疗缺血性心血管疾病的新的分子靶点。

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