李冰洁，张 睿，李庆林

(安徽中医药大学科研实验中心 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

酸枣仁(SemenZizyphiSpinosae，SZS)为鼠李科(Phamnaceae)枣属植物酸枣[ZizyphusjujubaMill.varspinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chou]的干燥成熟种仁[1]，分布于中国西北、东北、华北及南方一些地区，有宁心志、安魂魄、止虚汗、解渴除烦、安

神养血、益肝补中之功效[2]。酸枣仁皂苷是酸枣仁的水溶性成分，酸枣仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)是其中的主要有效成分[3]。研究表明，JuA对海马神经细胞的生长有促进作用，能明显提高海马神经细胞的存活率，且呈现一定的剂量相关性[4]。此外，JuA作为抗炎、抗氧化的神经保护药物作用于阿尔茨海默病[5]，表明JuA对神经系统有一定的保护作用。

星形胶质细胞是神经组织内数量最多、分布最广的胶质细胞，作为神经系统主要的神经细胞，在中枢神经系统中负责提供营养，维持神经递质传递和广泛维持脑内环境平衡[6-7]。近年来研究表明，星形胶质细胞也参与了多种神经系统疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症。这些神经变性疾病的发病机制都与星形胶质细胞氧化损伤相关[8-9]。氧化损伤后星形胶质细胞将不能正常行使对神经细胞的保护功能，并产生一系列的改变，如减弱或逆转其清除自由基、摄取谷氨酸、调节细胞外K+等作用，从而使原始损伤加重，促进神经损害的发展[10]。因此，抑制星形胶质细胞的氧化损伤可能是神经系统疾病治疗的一个重要方向。JuA对神经细胞损伤有一定的保护作用，但目前尚无文献报道JuA对星形胶质细胞氧化损伤具有干预作用。基于此，本实验通过建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导星形胶质细胞氧化性损伤模型，研究JuA对星形胶质细胞的影响，从而探讨JuA是否可以通过调控星形胶质细胞的氧化应激发挥神经保护作用。

1 材料

1.1 试剂 大鼠星形胶质细胞C6：中国科学院上海生命科学研究院细胞库；JuA(分子式C58H94O26，分子量1 207.35，批号 55466-04-1，纯度>95%)：南京狄尔格医药科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；批号 11012-8611)：杭州四季青生物工程材料有限公司；LPS(批号 L2630)、胰蛋白酶(批号 0458)、Griess试剂(批号 03553)和DMSO(批号 D2650)：Sigma；DMEM/F12培养基(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素；批号 12500-062)：Gibco BRL公司；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2；批号 1233009)：Sigma进口分装，沃德赛斯生物公司；L-噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT；批号 PB180520]：Sigma分装，武汉生命技术有限公司；胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP；批号 ab10062)抗体：Abcam；青霉素-链霉素溶液(批号 C0222)、活性氧检测试剂盒(含DCFH-DA染料；批号 S0033)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(批号 S0131)、总谷胱甘肽(L-glutathione，GSH)检测试剂盒(批号 S0052)和总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒(批号 S0101)：上海碧云天生物技术公司。

1.2 仪器 高压蒸汽灭菌锅：日本Tomy KOQYO公司；MCO-175型CO2培养箱：日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型洁净工作台：苏净集团安泰公司；CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司；LD4-8型低速离心机：北京医用离心机厂；Spectra Max M5多功能酶标仪：美国MD公司；流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 C6细胞培养 将C6细胞用37 ℃水浴复苏，待完全融化后接种于25 cm2的培养瓶中，选用DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养。待细胞长至80%～90%，按照1∶2或1∶3比例传代培养，待细胞长至对数生长期时即可用于实验。

2.2 MTT法检测JuA对C6细胞活力的影响 选取对数生长期状态良好的C6细胞，胰酶消化，细胞悬液按照每孔1×104密度接种于96孔板，每孔100 μL，每组设6个复孔，空白对照组加入等容积PBS；待细胞贴壁后，正常对照组换用完全培养基，给药组加入不同浓度(0.125、1.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的JuA培养24 h，再每孔加入50 mg/mL的MTT 20 μL继续孵育4 h，吸去培养基，加入150 μL的DMSO，置于摇床上震荡10 min，在酶标仪490 nm处检测各孔吸光度值。细胞存活率的计算公式：存活率=(给药组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

2.3 Western blot检测GFAP蛋白表达 取对数生长期C6细胞，以1×105密度接种于25 cm2培养瓶中，分成正常对照组、模型组和给药组。正常对照组正常培养，未加JuA和LPS，模型组将浓度为1 μg/mL的LPS加至C6细胞培养液共同培养24 h[11]；给药组用12.5、25、50 μmol/L JuA干预4 h，其他处理方法与模型组相同。孵育24 h后，在低温条件下用细胞裂解液(含PMSF)提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。使用10%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳和湿转法转膜；再用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h；在4 ℃下加一抗(1∶2 000)孵育过夜。次日，用PBST每隔10 min洗膜1次，共3次；在含有HRP标记的二抗(1∶5 000)室温下孵育2 h后，PBST洗膜。最后，配制ECL试剂，曝光，分析。

2.4 Griess法检测一氧化氮(nitric oxide, NO)水平 选用对数生长期C6细胞，胰酶消化后将细胞悬液以每孔1×105的密度接种于24孔板中，每孔1 mL。待细胞贴壁后，按“2.3”项进行实验分组及给药处理，24 h后收集细胞上清，以每孔100 μL加至96孔板中，再加入100 μL Griess试剂，37 ℃避光孵育10 min，使用酶标仪在540 nm处测定吸光度值。

2.5 流式细胞术检测细胞中活性氧族(reactive oxygen species，ROS)含量 取对数生长期C6细胞，消化收集后，取每孔4×105的细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL。待细胞在培养箱中完全贴壁，按“2.3”项方法进行实验分组及给药处理，24 h后，小心吸取培养液，胰酶消化后离心，用PBS清洗重悬后，加入含有DCFH-DA荧光染料的无血清培养基，37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min震荡离心管，使荧光探针与细胞充分接触；再用PBS洗涤3次，去除多余的荧光染料，重悬收集细胞，于流式细胞仪上以激发波长488 nm、发射波长525 nm进行检测。

2.6 细胞内MDA、GSH水平和SOD活性的检测 按“2.5”项方法进行分组、给药与种板培养，在5% CO2、37 ℃的培养箱培养24 h后，小心吸取培养液，PBS清洗后，用细胞刮刮取细胞；将装有细胞悬液的离心管置于冰水浴中，使用超声细胞破碎仪破碎细胞(超声时间3 s，间隔时间5 s，共5次)，再收集上清液，按检测试剂盒说明书进行操作，测定MDA、GSH水平和SOD活力。

3 结果

3.1 JuA对C6细胞存活率的影响 0.125～50 μmol/L JuA作用C6细胞24 h后，与正常对照组(0 μmol/L JuA组)相比，C6细胞存活率无明显变化(P>0.05)，表明此浓度范围内，药物对细胞生长无明显影响。见图1。

注：与正常对照组比较，*P<0.05

3.2 JuA对LPS诱导的C6细胞GFAP蛋白表达水平的影响 与正常对照组比较,模型组GFAP蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；12.5～50 μmol/L JuA作用细胞24 h后，与模型组比较，各给药组GFAP蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

3.3 JuA对LPS诱导的C6细胞内NO水平的影响 与正常对照组(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比较，模型组(1 μmol/L LPS)NO水平明显升高(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6细胞24 h后，各给药组NO水平较模型组明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，50 μmol/L JuA单独作用细胞，细胞内NO水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 JuA对LPS诱导的C6细胞内ROS水平的影响 与正常对照组(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比较，1 μg/mL LPS作用C6细胞，细胞内ROS水平显著升高(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6细胞24 h后，各给药组细胞内ROS水平显著降低(P<0.05)。见图4。

3.5 JuA对LPS诱导的C6细胞内MDA、GSH水平和SOD活性的影响 与正常对照组(0 μmol/L LPS+0 μmol/L JuA)比较，模型组C6细胞内MDA表达水平明显增加(P<0.05)，GSH水平和SOD活性则明显降低(P<0.05)；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6细胞24 h后，与模型组比较，各给药组MDA水平明显降低(P<0.05)，GSH水平和SOD活性明显增加(P<0.05)。见图5、图6和图7。

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

LPS由细菌细胞壁被破坏而释放出来，是革兰氏阴性细菌细胞壁中的成分，是一种内毒素；LPS刺激机体产生的大量ROS自由基会导致机体的氧化应激反应[12]。以LPS诱导建立氧化应激模型已在许多研究中得到应用，如用LPS诱导星形胶质细胞建立氧化应激模型，研究紫菀抗氧化和抗炎的作用机制[13]。

GFAP是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在于中枢神经系统的星形胶质细胞中[14]，在细胞骨架重新建立、细胞间的黏附、髓靴之间的连接及多种信号的传导途径等细胞活动中具有重要意义，GFAP仅存在于星形胶质细胞，具有标志性[15]；因此可利用GFAP特异性抗体来检测星形胶质细胞活性。本实验中，与正常对照组比较，模型组C6细胞内GFAP蛋白活性显著上调(P<0.05)，表明LPS可诱导星形胶质细胞活性增强；各浓度JuA可以有效地下调GFAP蛋白表达(P<0.05)，表明JuA具有一定的降低星形胶质细胞活性的作用。

NO是一种简单却不稳定的自由基，参与多种生理和病理过程。大量NO与超氧阴离子发生反应，生成的过氧化亚硝酸阴离子，氧化性极强，导致机体发生氧化损伤，引发神经退行性疾病[16]。实验结果显示，与正常对照组相比，LPS作用后，细胞内NO释放明显增加；与模型组比较，JuA给药组可以显著抑制C6细胞NO的释放(P<0.05)，表明JuA可以有效地抑制LPS诱导的NO释放。

氧化应激最直接的表现就是在机体遭受各种有害刺激时，ROS生成加剧会导致氧化和抗氧化水平失衡，所引起的生物化学变化则会导致各种病理过程，尤其是神经退行性疾病。神经退行性疾病的形态特征是特异性易感神经细胞出现进行性细胞损失，通常与细胞骨架蛋白聚集体在神经细胞或神经胶质细胞中形成内含物相关。异常聚集的蛋白质和被破坏的金属离子稳态都与氧化应激高度相关[17]。MDA、GSH、SOD都是氧化应激的产物，是检测氧化应激的重要指标。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量可以间接地反映氧化应激和星形胶质细胞活化的程度。GSH可去除细胞内脂质和通过有机过氧化反应所生成的毒物，具有保护细胞免受自由基损伤，维持细胞膜还原状态的作用。SOD则是以超氧阴离子为底物的抗氧化酶，在维持生物机体内超氧阴离子产生和消除的动态平衡中起着极其重要的作用，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[18-20]。实验结果显示，与正常对照组比较，LPS组C6细胞内ROS和MDA水平明显升高，GSH水平和SOD活性明显降低，表明LPS诱导细胞产生了氧化损伤；12.5、25、50 μmol/L JuA作用C6细胞24 h后，C6细胞内ROS、MDA、GSH水平和SOD活性均有明显的改善(P<0.05)，表明各浓度JuA可以减弱细胞氧化损伤的程度。

综上所述，JuA具有抑制脂多糖诱导的C6细胞氧化损伤作用，本实验为JuA防治神经退行性疾病提供了一定的理论依据。

参考文献：

[1] 马进杰，刘萍，马百平.酸枣仁化学成分及其镇静催眠作用研究进展[J].国际药学研究杂志，2011，38(3)：206-208.

[2] 国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：343．

[3] 黄宜生，贾珏华，糜小英.酸枣仁皂苷A预处理对过氧化氢诱导大鼠心肌细胞凋亡的作用[J].西部中医药，2013，26(7)：8-11.

[4] 夏晴，游自立.枣仁皂甙A对海马神经细胞的影响[J].实验科学与技术，2007，5(5)：41-44.

[5] ZHI L，XU Z，LIU B，et al. Jujuboside A, a neuroprotective agent from Semen Ziziphi Spinosaea meliorates behavioral disorders of the dementia mouse model induced by Aβ1-42[J].Eur J Pharmacol，2014，738：206-213.

[6] IRAVANI M M，SADEGHIAN M，LEUNG C C，et al. Lipopolysaccharide-induced nigral inflammation leads to increased IL-1β tissue content and expression of astrocytic glial cell line derived neurotrophic factor[J]. Neurosci Lett，2012，510：138-142.

[7] 张宇，张美妮.星形胶质细胞在多发性硬化中作用的研究新进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2014(4)：290．

[8] MCGEER P L，MCGEER E G. Glial reaction in Parkinson’s disease[J]. Mov Disord，2008，23(4)：474-583.

[9] NUNOMURA A，TAMAOKI T，MOTOHASHI N. Role of oxidative stress in the pathophysiology of neuropsychiatric disorders[J]. Seishin Shinkeigaku Zasshi，2014，116(10)：842-858.

[10] HASSLER S N，JOHNSON K，HULSEBOSCH C. Reactive oxygen species and lipid peroxidation inhibitors reduce mechanical sensitivity in a chronic neuropaynic pain model of spinal cord injury in rats[J]. J Neurochem，2014，131(4)：413-417.

[11] YAO J，CAO X，ZHANG R，et al. Protective effect of baicalin against experimental colitis via suppression of oxidant stress and apoptosis[J]. Pharmacogn Mag，2016，12(47)：225.

[12] 肖定福，钟佳，刘进辉，等.壳寡糖对脂多糖诱导猪空肠上皮细胞氧化损伤的作用[J].动物营养学报，2016，28(7)：2090-2095.

[13] ZHANG Z J，ZHAO L X，CAO D L，et al. Curcumin inhibits LPS-induced CCL2 expression via JNK pathway in C6 rat astrocytoma cells[J].Cell Mol Neurobiol，2012，32(6)：1003-1010.

[14] RITURAJ N，PRADEEP K K，CHANDISHWAR N，et al. Evaluation of guggulipid and nimesulide on production of inflammatory mediators and GFAP expression in LPS stimulated rat astrocytoma, cell line (C6)[J]. J Ethnopharmacol，2010，27：625-630.

[15] BRAMBILLA R，MORTON P D，ASHIBAUGH J J，et al. Astrocytes play a key role in EAE pathophysiology by orchestrating in the CNS the inflammatory response of resident and peripheral immune cells and by suppressing remyelination[J]. Glia，2014，62(3)：452-467.

[16] PARK B J，GAMAL M E，LEE W S，et al. Synthesis and inhibitory effects of triarylpyrazoles on LPS-induced NO and PGE2 productions in RAW 264.7 macrophages[J]. Med Chem Res，2017，9(26)：2161-2171.

[17] CHEN X，GUO C，KONG J. Oxidative stress in neurodegenerative diseases[J]. Neural Regen Res，2012，7(5)：376-85.

[18] KUMAR A，KUMAR V，SINGH S K，et al. Imbalanced oxidant and antioxidant ratio in myotonic dystrophy type 1[J]. Free Radical Res，2014(4)：503-510.

[19] ZHOU C，ZHAO L，ZHENG J，et al. MicroRNA-144 modulates oxidative stress tolerance in SH-SY5Y cells by regulating nuclear factor erythroid 2-related factor 2-glutathione axis[J]. Neurosci Lett，2017，655：21-27.

[20] YU S，SHI M，LIU C，et al. Time course changes of oxidative stress and inflammation in hyperoxia-induced acute lung injury in rats[J]. Iran J Basic Med Sci，2015，18(1)：98-103.