朱 艳，俞红五，潘喻珍，杨 佳，吴炳坤，胡 雪，曹云燕

(安徽中医药大学第二附属医院老年病科,安徽 合肥 230061)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的具有致残性的全身自身免疫性疾病，主要侵犯关节滑膜，引起关节滑膜炎，随着病程的进展会影响到心、肺、血管等重要脏器和组织，关节本身病变引起的关节畸形则导致患者生活不能自理，严重影响生活质量[1-3]。艾灸作为传统的外治方法，能够温经通络、活血祛瘀，既可以消除局部的寒凝、湿阻、瘀血，以改善局部血液循环，促进新陈代谢，又可以提高机体免疫功能和抗病能力，达到有效地治疗本病的目的[4]。本课题组前期的研究证实，艾灸能够改善RA患者的关节疼痛症状，能够提高临床疗效，但对于艾灸治疗RA的机制未进行深入研究[5]。

代谢组学作为新兴学科，其整体性、动态性、即时性的特点与中医有明显的共性，因此代谢组学可以为艾灸治疗RA的研究提供新方法。通过代谢组学方法寻找艾灸调节RA的标志性代谢产物及其代谢通路，明确相关物质的变化趋势，能够为中医治疗RA研究搭建现代化科技平台。

基于此，本研究以代谢组学为检测手段观察艾灸对弗氏完全佐剂(Freund’s adjuvant complete, FCA)诱导的RA模型大鼠尿液中内源性代谢物的影响，初步探索艾灸干预RA的作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级Wistar雄性大鼠80只，体质量(150±10)g，由安徽省医学科学研究所动物房提供。实验室保持恒温、恒湿，动物在明暗周期为12/12 h(明期6:00-18:00)条件下进行适应性饲养。

1.2 药品 与试剂特制香烟型纯艾条(直径1 cm)：河南省南阳市卧龙汉医艾绒厂；雷公藤多苷片(Tripterygiumwilfordiipolyglycosidetablet, TPT):每片10 mg，上海复旦复华药业有限公司；FCA:美国Sigma公司。

1.3 仪器 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC/MS)：美国安捷伦公司。

2 方法

2.1 模型复制方法 采用风、寒、湿环境因素+生物因子复合方法[6]复制RA模型。将大鼠放置在自制铝合金、玻璃箱内，超声雾化器控制箱内湿度，加冰块，使箱内环境温度控制在(6±2)℃，湿度80%～90%，电风扇风力定于高档。所有需要复制模型的大鼠均被放入上述风、寒、湿环境中20 d，每日12 h(20:00-8:00)。第21天给大鼠足跖部注射FCA 0.5 mL致炎，以复制RA模型。观察3 d，以24 h出现足踝部肿胀等急性炎性反应，48 h出现继发性全身多发性关节炎，表现为前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或炎性结节出现，提示模型复制成功。

2.2 分组及治疗 将模型复制成功的大鼠随机分为模型对照组、TPT组和艾灸组，每组20只，另取20只未复制模型的大鼠作为正常对照组。

2.2.1 艾灸组 参照文献[4]选取“足三里”“肾俞”穴，根据大鼠穴位图谱作穴区定位，剪毛，标记颜色。致炎3 d后，艾灸组用特制香烟型纯艾条距穴位2 cm处悬灸，每日治疗1次，选1穴，两穴交替使用，每次20 min，连续治疗15 d。

2.2.2 TPT组 采用雷公藤溶液灌胃给药，每日8 mg/kg，每日1次，共给药15 d，每只大鼠给药总量不超过24 mg[3]。

2.2.3 正常对照组和模型对照组 两组大鼠均予以与TPT组等容积的生理盐水。

2.3 尿液代谢组学检测 在末次治疗24 h后，各组各取7只大鼠置于代谢笼，留取24 h尿液，摇匀后收集尿液5 mL，加1% NaN 3溶液作为防腐剂，样品收集后经3 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃储存，用于代谢组学检测。取20 μL解冻尿液，加入等容积尿酶溶液(1 000 U)，37 ℃孵化60 min，分解尿素；加入240 μL冰冷乙醇，涡旋振荡30 s，-20 ℃静置60 min，在4 ℃和16 000×g条件下离心15 min；取200 μL上清液，干燥；向干燥物中加入30 μL浓度为20 mg/mL盐酸羟胺吡啶，涡旋振荡30 s，37 ℃处理90 min；继续加入30 μL的BSTFA(含1% TMCS)，于70 ℃衍生60 min。

采用安捷伦7890A/5975C GC-MS联用仪对尿液衍生物进行非靶向代谢组学检测。色谱柱为安捷伦公司的HP-5ms熔融硅毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气为高纯氦气(>99.999%)，流速恒定为1 mL/min，进样量为1 μL(无分流模式)，溶剂延迟时间为6 min。柱温程序：初始柱温70 ℃，维持2 min，以6 ℃/min升温至160 ℃，再以10 ℃/min升温至240 ℃，最后以20 ℃/min升温至300 ℃并维持6 min。进样口、传输线和电子碰撞(EI)离子源温度分别设定为250、290、230 ℃。EI能量为70 eV。以全扫描模式对质荷比(m/z)范围50～600内的所有数据进行采集。

2.4 质谱数据预处理与统计分析 参照文献[7]方法对GC-MS检测得到的原始数据进行质谱数据预处理，包括峰识别、保留时间校正、峰对齐和反卷积分析，得到包含观察量(样本名)、变量(峰，即rt_mz)和丰度(峰面积)的峰表矩阵数据文件。对每个样本中各峰的丰度进一步按照面积归一化法进行处理。然后将该数据导入SIMCA软件(版本13.0，Umetrics，Sweden)，按默认设置进行主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)，建立含最优主成分的统计模型。

2.5 差异性代谢物筛选与结构鉴定 PLS-DA分析是寻找差异性代谢物最常用的方法之一[8]。本项目根据PLS-DA的变量投影重要性(variable importance in the projection，VIP)大于1为阈值初步筛选差异代谢物。进一步采用SPSS 17.0进行单维统计分析(t检验)，筛选具有统计学意义(P<0.05)的代谢物。本项目结合PLS-DA模型的VIP值和t检验的P值进行联合筛选，将同时满足VIP>1和P<0.05的变量(代谢物)筛选为差异代谢物[9]，并进一步进行结构鉴定。差异性代谢物含量在两组之间的倍数为归一化的数据在两组之间的比值(如组1/组2)的对数(以2为底)，正值表示组1大于组2，负值表示组1小于组2。差异性代谢物的结构鉴定程序：首先采用AMDIS软件反卷积GC/MS原始数据，得到纯化的质谱数据，然后与自建的标准品数据库(包括保留时间)、Golm Metabolome Database和Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library自动进行比对，纳入标准为匹配相似度大于80%。

3 结果

3.1 尿液样本的GC/MS代谢组学检测 采用目前较为成熟的GC/MS代谢组学平台技术对尿液样本进行检测。各组代表性总离子流色谱图(TIC)如图1所示，可见当前样本的GC/MS检测具有峰容量大、信号强且保留时间重现性好等优点。对样本制备过程中添加的内标(半乳糖醇)进行统计分析，发现内标丰度的变异系数(CV值)小于5%(4.96%)，说明当前的代谢组学检测方法是可靠的。由于共流出峰的存在，数据相当复杂，故采用已发表的GC/MS代谢组学数据处理方法对采集到的质谱数据进行质谱数据预处理，将复杂的质谱信号转化成有用的定性定量数据，以表征群体之间的代谢特征。在下面的分析中，将采用多维统计和单维统计相结合的方法来获得组学特征。

3.2 PCA分析 为了处理复杂的代谢组学数据，笔者采用PCA对数据进行降维，建立模型。该模型得到6个有效主成分，解释率R2X为0.817，预测率Q2为0.588。通常，它们的值大于 0.5，即表示模型质量较好[6]，因此该PCA模型是可靠的。图2A为PCA得分图，其中3个质控样本(QC)聚集在PCA得分图中间，表明当前的代谢组学方法稳定性好、可靠，适合于对各组样本进行可视化表征。正常对照组分布于第一主成分(用t[1]表示)左侧，而其他3组则分布于右侧并从整体上交织在一起。PCA模型常用于真实地反映各组间的差异，但是由于代谢组较基因组、转录组和蛋白质组灵敏，受到遗传背景和环境干扰的影响比基因组、转录组和蛋白质组大得多，对于哺乳动物来说，尤为明显，通常导致组间的固有差异被干扰。

注：A.正常对照组；B.艾灸组；C.模型对照组；D.TPT组图1 各组尿液样本代表性总离子流色谱图

为了消除这种影响，通常采用监督性模型如PLS-DA进行分析。PLS-DA是基于偏最小二乘法线性回归、有监督的模式识别的统计分析方法，通常适用于样本量少、变量多、变量之间有相关性以及存在噪音变量干扰等情况[8]。去掉QC后，建立含6个有效主成分的PLS-DA模型，得分图见图2B和2C。模型累积解释率R2X为0.793，R2Y为0.974，累积预测率Q2为0.908。置换检验(permutation test)分析(图2D)表明当前模型不存在过拟合现象。而CV-ANOVA分析的P值为0.002 8，也说明PLS-DA模型不存在过拟合现象。综上分析，说明当前建立的PLS-DA模型是可靠的。图2B显示正常对照组与其他3组在第一主成分上具有显著差异，而治疗后与治疗前在第二主成分上具有较显著的差异，表明TPT和艾灸均对RA模型大鼠代谢产生明显的干预效果。图2C显示TPT组和艾灸组在第3主成分上具有显著差异，说明二者的治疗作用又是不同的。因此，尿液代谢组学多维统计分析表明，TPT和艾灸对RA大鼠的代谢均具有一定干预效果，且二者的作用存在差异。

3.3 潜在生物标志物的鉴定 为了筛选出导致各组之间显著不同的代谢谱的代谢物，两个重要参数即PLS-DA模型的VIP和t检验的P值被用于筛选潜在的生物标志物。那些VIP>1(表示这些变量对聚类具有高于平均水平的影响)的差异变量和P<0.05被筛选为差异性代谢物，这些代谢物贡献于组间显著的代谢差异。对比正常对照组和模型对照组，最终从尿液中筛选并鉴定到9个差异性代谢物，主要涉及氨基酸、嘧啶、脂肪酸和肠道菌群等代谢通路。各组大鼠主要差异性尿液代谢物相关系数比较见表1。由表1可见，正常对照组较模型对照组的变化主要体现于色氨酸、对羟基肉桂酸、羟基苯丙酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、喹啉酸、脱氧核糖水平低下，油酸、胆固醇水平升高；艾灸组较模型对照组的变化主要体现于氨基丁酸、甲基胞嘧啶、喹啉酸、脱氧核糖水平升高；TPT组较模型对照组的变化主要体现于胆固醇水平低下，油酸、对羟基肉桂酸、羟基苯丙酸水平升高；TPT组较艾灸组的变化主要体现于胆固醇、甲基胞嘧啶、喹啉酸、氨基丁酸、脱氧核糖水平升高。

4 讨论

艾灸疗法作为中医针灸学重要组成部分，其继承和创新，需要应用现代科学技术与方法对其作用机制进行全方位的研究，以阐释艾灸作用机制的科学内涵。代谢组学这种具有生命科学整体水平和总联系的研究方法的出现，与艾灸的整体性调节效应相契合，符合中医整体观和动态平衡观。因此，基于代谢组学研究艾灸治疗RA的效应与作用机制，更符合研究的实际需要，将有利于从生物系统的整体水平深入、系统地阐释艾灸治疗RA的作用机制，推动艾灸疗法的临床运用。

图2 PCA和PLS-DA得分图及PLS-DA模型置换检验分析

代谢物模型对照组/正常对照组艾灸组/正常对照组TPT组/正常对照组TPT组/艾灸组代谢途径油酸-0．94-2．59-脂肪酸代谢胆固醇1．21--0．210．57脂肪酸代谢色氨酸-1．98--0．67色氨酸代谢对羟基肉桂酸-1．96-1．77-酪氨酸代谢4⁃羟基苯丙酸-1．91-1．77-酪氨酸代谢2⁃氨基丁酸-2．481．22-0．92氨基酸代谢5⁃甲基胞嘧啶-1．021．11-0．67嘧啶代谢喹啉酸-0．490．46-0．53色氨酸代谢脱氧核糖-1．282．10-1．65氨基酸代谢

注：差异性代谢物相关系数为两组均值之比的对数值(以2为底)，“+”表示含量上升，“-”表示含量下降

本研究从尿液代谢组学角度研究艾灸对RA模型大鼠的作用机制。依据PCA结论，研究发现变化过程的重要因子依次为油酸、胆固醇、色氨酸、对羟基肉桂酸、4-羟基苯丙酸、胞嘧啶、氨基丁酸、喹啉酸、脱氧核糖形成过程中各阶段代谢标志物。内源性代谢信息的扰动主要影响的代谢通路涉及氨基酸代谢、嘧啶代谢、脂质代谢。

脂肪、蛋白质和糖类为体内三大营养物质，因此脂质代谢和氨基酸代谢与能量代谢密切相关。本研究发现氨基丁酸、色氨酸、羟基肉桂酸、脱氧核糖归属于氨基酸代谢的产物，而胆固醇、油酸归属于脂质代谢的产物，胞嘧啶和脱氧核糖则为嘧啶代谢。

RA患者的血脂代谢和炎性反应程度与其发生心血管疾病危险性有关，通过药物干预RA患者的炎症的同时脂质代谢亦发生相应的改变[10]。而研究发现油酸可降低血液总胆固醇和有害胆固醇，却不降低有益胆固醇。亚油酸具有能降低总胆固醇、三酰甘油，预防动脉粥样硬化，促进细胞代谢，改善细胞再生的作用[11]。本实验结果发现，RA模型大鼠尿液中参与脂肪代谢的胆固醇水平均增高而油酸水平下降，经艾灸干预后的RA模型大鼠尿液中胆固醇代谢物水平均下调，提示艾灸可逆转脂肪代谢异常，起到调脂的作用。

羟基肉桂酸即对香豆酸，广泛存在于自然界植物当中，为白花蛇舌草、海金沙草、杜仲叶的有效成分之一，具有预防心血管疾病、抗菌消炎等对人体有益的生物活性[12]。另外，对香豆酸是氨基酸代谢途径的中间产物，是合成类黄酮、异黄酮等高价值保健营养品的中间体。氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有良好的降血压功效，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能[13]。现代研究发现，在RA机体内发生了L-色氨酸、嘌呤核苷酸等代谢物谱的变化，提示RA的发生与能量代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、葡萄糖代谢、核酸代谢等密切相关，表明色氨酸代谢障碍与机体免疫耐受有关[14]。本实验结果亦发现，RA模型大鼠尿液中色氨酸、对羟基肉桂酸、对羟基苯丙酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、脱氧核糖水平明显下降，经艾灸干预后色氨酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、脱氧核糖水平明显上升，说明艾灸亦参与了氨基酸代谢。

综上所述，艾灸及TPT均可使RA异常的氨基酸、嘧啶及脂质代谢发生逆转，提示艾灸及TPT均可调控RA体内氨基酸、嘧啶及脂质代谢通路，而艾灸在调控氨基酸代谢方面明显优于TPT组。艾灸调控氨基酸代谢可能是其治疗RA的特异性体现。

参考文献：

[1] 丁菱,何善智,王敏,等.类风湿关节炎合并肺间质病变危险因素分析[J].重庆医学,2017,32(6):3269-3271.

[2] 刘贵艳,边森,李芳,等.类风湿关节炎合并心血管损害危险因素及治疗的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2017,11(3):492-496.

[3] CORRAO S, MESSINA S, PISTONE G, et al. Heart involvement in rheumatoid arthritis: systematic review and meta-analysis[J].Int J Cardiol，2013,167(5): 2031-2038.

[4] HU L, DIRCKINCK-HOLMFELD L, SONG X G, et al. Effect of moxibustion on IL-1B and IL-2 in rat models of rheumatoid arthritis[J].J Acupunct Tuina Sci,2010,8(3):149-153.

[5] 俞红五,朱艳,潘喻珍,等.艾灸辅助治疗类风湿关节炎患者临床疗效观察及机制探讨[J].中国针灸,2016,36(1):17-20.

[6] 唐照亮,宋小鸽,章复清,等.艾灸治疗类风湿性关节炎抗炎免疫作用机理的研究[J].针刺研究,2003,28(4):292-298.

[7] GAO X, PUJOS-GUILLOT E, SEBEDIO J-L. Development of a quantitative metabolomic approach to study clinical human fecal water metabolome based on trimethylsilylation derivatization and GC/MS analysis[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(15): 6447-6456.

[8] SZYMANSKA E,SACCENTI E,SMILDE A K, et al. Double-check: validation of diagnostic statistics for PLS-DA models in metabolomics studies[J]. Metabolomics,2012,8(1):3.

[9] DENG M,ZHANG M,HUANG X, et al. A gas chromatography mass spectrometry based study on serum metabolomics in rats chronically poisoned with hydrogen sulfide[J]. J Forensic Leg Med,2015,32(5):59.

[10] 刘燊仡.活血化瘀法对类风湿关节炎脂质紊乱的干预作用临床观察[J].世界中医药,2016,11(9):1766-1772.

[11] 刘晓燕,王瑞.朱砂根挥发油的超临界CO2萃取工艺优选及GC-MS分析[J].时珍国医国药,2008,19(11):2738-2739.

[12] 冉桂梅,何彬,杨凌,等.对香豆酸在大鼠体内的药动学研究[J].中国药学杂志,2005,40(24):1889-1891.

[13] 章桃,贾岩龙,聂婷婷.17.0 TMR γ-氨基丁酸化学交换饱和转移成像的新技术研究[J].技术研究,2015,6(5):382-389.

[14] 杜小正,袁博,王金海.“热补针法”对类风湿关节炎模型家兔尿液代谢物的影响[J].中国针灸,2017,37(1):55-60.