余 俊，刘彤鸥，李晓兰

(1.湖北中医药大学第一临床学院 湖北省中医院妇产科，湖北 武汉 430061；2.宜昌市第二人民医院妇产科，湖北 宜昌 443000)

宫颈癌为女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、侵袭力强、预后差等特点，近年来发病率逐年上升，且呈年轻化趋势[1]，严重威胁女性健康。目前，宫颈癌的发生机制尚未完全明确。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作为存在于细胞质中的非受体酪氨酸蛋白激酶，参与机体多条信号传导通路，在调控细胞增殖、黏附、迁移、运动中发挥重要作用[2]。近年来研究发现，FAK在肿瘤的发生中发挥关键性作用，与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及血管新生密切相关[3]。本研究利用小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术特异性沉默人宫颈癌Hela细胞的FAK基因，观察其对细胞生物学特征的影响，并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1细胞来源人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，由湖北省中医院检验科细胞室保存。

1.2主要试剂与仪器达尔伯克改良伊格尔培养基F12(Dulbecco′s modified Eagle′s medium：nutrient mixture F-12，DMEM/F12)、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibo公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒、TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，FAK及内参引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，siRNA-FAK、siRNA-阴性对照序列均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，噻唑蓝[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司，Annexin V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(annexin V fluoresceinisothiocyanate/propidiumiodide，annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海优宁维生物科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，兔抗人RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶-1(RAF proto-oncogene serine/threonine kinase 1，Raf-1)单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人FAK多克隆抗体、兔抗人磷酸化Raf-1(phosphorylation of Raf-1，p-Raf-1)抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人丝裂原活化蛋白激酶1/2(mitogen-activated protein kinase 1/2，MEK1/2)多克隆抗体、兔抗人磷酸化-MEK1/2(phosphorylation of MEK1/2，p-MEK1/2)多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)单克隆抗体、兔抗人磷酸化-ERK(phosphorylation of ERK，p-ERK)多克隆抗体购自美国CST公司，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)购自济南朋远生物科技有限公司，增强化学发光法(enhanced chemilluminescence，ECL)试剂盒购自美国Promega公司，AMR-100全自动酶标分析仪购自成都昱强科技有限公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad 公司，凝胶电泳分析系统购自美国GENE公司。

1.3细胞培养及分组处理取人宫颈癌Hela细胞，置于含体积分数10%胎牛血清及链霉素和青霉素各100×103U·L-1的DMEM/F12中，于含体积分数5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，1～2 d换液1次，待细胞融合度达到80%以上时进行传代培养。取对数生长期细胞，按每孔2×105个细胞接种于6孔培养板中，然后在37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中培养24 h，将细胞分为siRNA-FAK组(细胞转染FAK基因干扰序列：5′-CGCGTCGTAAATGCCTTGATGTACATCTTTGATATC-CGAGATGTACATCAAGGCATTTATTTTTTCCAAC-3′)、siRNA-阴性对照组(细胞转染阴性对照序列：5′-CGCGTCGTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTGATATCC-GCTTACGCTGAGTACTTCGATTTTTTCCAAC-3′)和空白对照组(细胞不作任何处理)。具体操作按LipofectamineTM2000试剂盒说明进行。

1.4实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中FAK基因表达取各组转染后培养48 h的细胞，每组约5×103个细胞，加入细胞裂解液，用TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，检测总RNA纯度，取合格样品，用反转录试剂盒反转录为模板链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。FAK引物序列：上游为5′-CCCTGCTGACAGCTACAACG-3′，下游为5′-GCCCGTCACATTCTCGTACA-3′；β-actin引物序列：上游为5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，下游为5′-ATCACAATGCCAGTGGTACG-3′。PCR反应条件：第1个循环为95 ℃预变性5 min，接着行38个PCR循环：95 ℃变性30 s，60 ℃延伸30 s。每个样品均设6个平行反应复孔。采用2-ΔΔCt法获得各组细胞中FAK mRNA相对表达量。

1.5MTT法检测各组细胞增殖能力取各组细胞，胰蛋白酶消化后接种于96孔板，每孔2×104个细胞，各组均设6个复孔，于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温箱培养，分别于培养12、24、48、72、96 h 时，每孔加入5 g·L-1的MTT液20 μL，37 ℃孵育 4 h，每孔加入体积分数0.5%的二甲基亚砜 200 μL，充分摇晃均匀后，利用全自动酶标分析仪于490 nm处检测各孔吸光度值。

1.6流式细胞术检测各组细胞凋亡情况取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化后接种于6孔板，每孔1×105个细胞，加入5 μmol·L-1的Annexin V标记液5 μL，加入10 μmol·L-1的PI液 5 μL，室温下避光孵育20 min，加入1×结合缓冲液，60 min内上机检测，每组重复实验6次，取均值。

1.7Transwell法检测各组细胞迁移能力取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化后应用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×108L-1。取200 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，将含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液置于小室下室，将Transwell小室置于恒温培养箱中培养12 h。取出后，将上室内散落的细胞去除，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗3次，用甲醛固定20 min，结晶紫染色15 min，PBS冲洗3次，倒置显微镜下观察，随机取10个高倍视野计数穿膜细胞数，取均值。

1.8Transwell法检测各组细胞侵袭能力将 50 mg·L-1基质胶按18稀释后平铺于Transwell小室上室，风干后备用。用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×108L-1。取200 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，将含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液置于小室下室，将Transwell小室置于恒温培养箱中培养12 h。取出后，将上室内散落的细胞去除，PBS冲洗3次，用甲醛固定 20 min，结晶紫染色15 min，PBS冲洗3次，倒置显微镜下观察，随机取10个高倍视野计数穿膜细胞数，取均值。

1.9Westernblot法检测各组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表达取各组转染后培养48 h的细胞，每组约 5×103个细胞，加入细胞裂解液，用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，利用Bradford法对各组蛋白浓度进行检测。取各组50 μg总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜。用脱脂奶粉封闭60 min，将各组细胞再次进行分组，分别加入一抗兔抗人FAK多克隆抗体、Raf-1单克隆抗体、p-Raf-1抗体、MEK1/2多克隆抗体、p-MEK1/2多克隆抗体、ERK单克隆抗体、p-ERK多克隆抗体(稀释比例分别为1500、11 200、11 000、1500、11 500、1800、11 000)，4 ℃过夜孵育，用洗膜缓冲液(tris buffered saline tween，TBST)洗膜3次，加入二抗，孵育60 min，用TBST洗膜3次，加入ECL发光液，避光反应15 min，曝光充分后拍照。所有实验重复6次。

2 结果

2.1各组细胞中FAKmRNA表达比较空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.03±0.01、0.34±0.05，3组细胞中FAK mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(F=74.559，P<0.05)。空白对照组与siRNA-阴性对照组细胞中FAK mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较，siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA的相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组细胞增殖能力比较结果见表1。培养24、48、72、96 h时，空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组培养细胞增殖能力比较差异有统计学意义(F=9.389、14.804、14.945、18.135，P<0.05)。培养24、48、72、96 h时，空白对照组与siRNA-阴性对照组细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)；培养24、48、72、96 h时，siRNA-FAK组细胞增殖能力显著低于空白对照组和siRNA-阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1各组细胞细胞增殖能力比较

组别n细胞增殖能力24h48h72h96h空白对照组60．43±0．090．55±0．060．70±0．110．79±0．08siRNA⁃阴性对照组60．42±0．110．58±0．100．68±0．080．81±0．12siRNA⁃FAK组60．31±0．12ab0．40±0．08ab0．49±0．07ab0．58±0．10abF9．38914．80414．94518．135P0．0020．0000．0000．000

注：与空白对照组比较aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较bP<0.05。

2.3各组细胞凋亡率比较结果见图1。空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组细胞凋亡率分别为(7.2±1.8)%、(10.6±2.8)%、(16.6±3.8)%，3组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=15.884，P<0.05)。空白对照组和siRNA-阴性对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较，siRNA-FAK组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：siRNA-FAK组；B：siRNA-阴性对照组；C：空白对照组。

图1流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

Fig.1Detectionofapoptosisbyflowcytometryineachgroup

2.4各组细胞迁移和侵袭能力比较结果见表2、图2和图3。空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组细胞迁移细胞数和侵袭细胞数比较差异有统计学意义(F=12.301、20.598，P<0.05)。空白对照组和siRNA-阴性对照组迁移细胞数和侵袭细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较，siRNA-FAK组迁移细胞数和侵袭细胞数显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2各组细胞迁移和侵袭能力比较

组别n迁移细胞数侵袭细胞数空白对照组6119．2±23．5130．7±12．9siRNA⁃阴性对照组6106．6±18．6131．0±13．9siRNA⁃FAK组667．6±12．6ab84．9±15．9abF12．30120．598P0．0010．000

注：与空白对照组比较aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较bP<0.05。

A：siRNA-FAK组；B：siRNA-阴性对照组；C：空白对照组。

图2各组细胞迁移能力比较(结晶紫染色，×200)

Fig.2Comparisonofthecellmigrationabilityineachgroup(crystalvioletstaining，×200)

A：siRNA-FAK组；B：siRNA-阴性对照组；C：空白对照组。

图3各组细胞侵袭能力比较(结晶紫染色，×200)

Fig.3Comparisonofthecellinvasionabilityineachgroup(crystalvioletstaining，×200)

2.5各组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表达比较结果见表3和图4。空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=58.032、12.063、16.684、9.143、31.464、8.443、32.585，P<0.05)。空白对照组和siRNA-阴性对照组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较，siRNA-FAK组细胞中FAK、p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK蛋白相对表达量显著降低，而Raf-1、MEK1/2和ERK蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3各组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表达比较

组别nFAK蛋白Raf⁃1蛋白p⁃Raf⁃1蛋白MEK1/2蛋白p⁃MEK1/2蛋白ERK蛋白p⁃ERK蛋白空白对照组60．75±0．100．36±0．060．77±0．200．32±0．080．67±0．120．51±0．210．62±0．09siRNA⁃阴性对照组60．80±0．070．44±0．140．65±0．120．33±0．050．66±0．120．44±0．060．67±0．04siRNA⁃FAK组60．30±0．09ab0．61±0．03ab0．31±0．08ab0．60±0．20ab0．27±0．02ab0．79±0．15ab0．40±0．04abF58．03212．06316．6849．14331．4648．44332．585P0．0000．0010．0000．0030．0000．0030．000

注：与空白对照组比较aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较bP<0.05。

图4各组细胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表达(Westernblot)

Fig.4ExpressionsofFAK，Raf-1，p-Raf-1，MEK1/2，p-MEK1/2，ERKandp-ERKproteininthecellsineachgroup(Westernblot)

3 讨论

宫颈癌为女性第2位高发恶性肿瘤，每年我国有2万至3万名妇女死于该病[4]，目前，临床上尚无特效的治疗手段，尤其是对于晚期出现转移的患者，预后多数不良[5]。有研究指出，宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力较强是导致患者预后较差的主要因素[6]。因此，积极探讨宫颈癌增殖、迁移、侵袭的相关机制，对指导治疗及改善患者预后具有重要意义。FAK主要存在于细胞质，为一种具有酪氨酸激酶活性的激酶，是整合素分子信号通路下游重要因子，在整合素介导的细胞信号传导中发挥关键性作用[7]，与细胞增殖、生长、运动、凋亡等生物学功能密切相关[8]，FAK参与了肿瘤细胞的生长、转移过程[9]。同时，FAK可通过调控上皮-间质转化而加速肿瘤细胞迁移和侵袭[10]。本研究利用siRNA技术特异性抑制人宫颈癌Hela细胞中FAK基因，结果显示，空白对照组与siRNA-阴性对照组细胞中FAK基因和蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义，而siRNA-FAK组细胞中的FAK基因和蛋白相对表达量与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较均显著降低，提示Hela细胞中FAK基因表达被成功抑制。

本研究结果显示，与空白对照组和siRNA-阴性对照组相比，培养24、48、72、96 h时，siRNA-FAK组细胞增殖能力均显著降低，说明特异性抑制Hela细胞中FAK基因可抑制细胞增殖能力，提示FAK基因参与了Hela细胞增殖过程。有研究指出，FAK基因激活可通过一系列信号传导而促进周期素D1、周期蛋白依赖性蛋白激酶大量表达，从而推动细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖[11]。李吉友等[12]研究指出，下调FAK基因表达可促进人胃癌细胞凋亡，其机制可能是抑制FAK可激活细胞凋亡相关蛋白，从而启动细胞凋亡程序而加速细胞凋亡发生。这些研究提示FAK基因可能在肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用，有望为肿瘤分子治疗提供新的靶点。本研究流式细胞术检测结果显示，空白对照组和siRNA-阴性对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义，而siRNA-FAK组细胞凋亡率与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较显著增加，说明特异性抑制Hela细胞中FAK基因可促进细胞凋亡。

王军等[13]指出，FRK可能通过抑制FAK的磷酸化来调控胶质瘤的侵袭与迁移。阿力亚等[14]研究显示，下调FAK表达可影响肝癌细胞黏附迁移侵袭能力，其机制可能是通过调节相关细胞黏附分子的表达或活化而实现。本研究结果显示，空白对照组和siRNA-阴性对照组迁移细胞数和侵袭细胞数比较差异无统计学意义，而siRNA-FAK组迁移细胞数和侵袭细胞数与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较均显著降低，说明特异性抑制Hela细胞中FAK基因可抑制细胞迁移和侵袭能力，提示FAK基因参与了宫颈癌细胞迁移和侵袭过程。

Raf/MEK/ERK作为ERK信号通路中的主要路径，在细胞增殖、分化、恶性转化中发挥重要作用[15]，而该信号通路异常激活则与肿瘤发生、进展过程有关，在肿瘤细胞侵袭、转移中发挥重要作用[16]。有研究指出，Raf/MEK/ERK是整合素-FAK调控的主要信号通路之一，在细胞外信号传导至细胞核过程中发挥重要作用[17]。本研究结果显示，空白对照组和siRNA-阴性对照组细胞FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相对表达量比较差异无统计学意义；与空白对照组和siRNA-阴性对照组比较，siRNA-FAK组p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK蛋白相对表达量显著降低，而Raf-1、MEK1/2和ERK蛋白相对表达量显著升高，说明特异性抑制人宫颈癌Hela细胞中FAK基因，可显著抑制Raf/MEK/ERK信号活化，提示抑制FAK基因可能通过抑制Raf/MEK/ERK信号通路而减少细胞增殖，加速细胞凋亡，抑制细胞迁移和转移。

综上所述，特异性抑制人宫颈癌Hela细胞中FAK基因可减少细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭，其机制可能与抑制Raf/MEK/ERK信号通路有关。

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