疏肝健脾活血方对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响

2018-04-24夏雪皎张俊杰

浙江中西医结合杂志 2018年4期

周凝杨欣夏雪皎张俊杰

肝纤维化是逆转肝硬化发生发展的重要节点，研究[1]表明，肝纤维化最终的共同通路均是由肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）所调节的，同时研究发现转化因子β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）/Smads信号通路对HSC的活化增殖及肝纤维化的发生发展有重要影响。疏肝健脾活血方是浙江省名中医周庚生教授治疗肝纤维化的有效复方，本课题组前期研究表明疏肝健脾活血方对四氯化碳诱导的肝纤维化有保护肝细胞，减轻肝细胞炎症反应，抗肝纤维化的作用[2-6]。本研究以TGF-β1诱导HSC-T6作为活化的肝星状细胞的研究模型，从TGF-β1/Smads信号通路探讨疏肝健脾活血方延缓肝纤维化的细胞分子机制，为中药复方的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1实验材料清洁级雄性SD大鼠（体质量200±20g，购自浙江中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2015-0001）；疏肝健脾活血方（桃仁 15g，桂枝 10g，制大黄 6g，甘草 8g，香附、白术、莪术各10g，鳖甲 15g，参三七 3g，茯苓 15g，丹参、红枣各30g），中药均购自浙江中医药大学滨江中医门诊部；大鼠肝星状细胞株HSC-T6（上海第二军医大学张俊平教授惠赠）；重组人TGF-β1（购自R&D Systems公司，批号AV6915072）；五组shRNA重组慢病毒质粒（上海吉玛制药技术有限公司委托合成）；PCR引物（上海生工生物公司合成，见表1）。

1.2实验方法

1.2.1疏肝健脾活血方含药血清制备将疏肝健脾活血方中药饮片煎煮、滤出药液后水浴蒸发至2.7g/mL的浓度。取10只清洁级雄性SD大鼠按10mL/（kg·d）灌胃，连续3天，最后一次灌药1h后麻醉、腹主动脉采血，4℃、3000rpm（有效离心半径15cm），20min，离心分离血清，56℃水浴中灭活 30min，0.22μm微孔滤膜过滤，得到的含药血清配置成40%浓度备用。

1.2.2细胞转染选择慢病毒载体及四组shRNA表达重组慢病毒质粒加入绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），组装、浓缩、基因测序鉴定及滴度测定后证实插入序列正确。48h后荧光倒置显微镜下观察HSC-T6细胞GFP的表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative PCR，QRT-PCR）检测Smad4 mRNA的表达，筛选沉默Smad4（Smad4 mRNA interference，Smad4 RNAi）的HSCs-T6细胞株（Smad4 RNAi HSCs-T6）进行下一步的实验研究。

1.2.3细胞培养与分组将筛选出的Smad4 RNAi HSCs-T6细胞株和HSCs-T6细胞株接种于细胞培养瓶中，HSCs-T6细胞分组：空白对照组、TGF-β1模型组、TGF-β1+含药血清组；Smad4 RNAi HSCs-T6细胞分组：Smad4 RNAi组、Smad4 RNAi+TGF-β1模型组，Smad4 RNAi+TGF-β1+含药血清组；共六组。空白对照组用DMEM完全培养液培养，TGF-β1模型组、Smad4 RNAi+TGF-β1模型组再加用工作浓度为5ng/mL的TGF-β1试剂处理，TGF-β1+含药血清组及Smad4 RNAi+TGF-β1+含药血清组，再加用40%的疏肝健脾活血方含药血清处理，处理时间均为24h。

1.2.4酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorb-nent assay，ELISA）检测I型胶原蛋白的相对量上述六组处理24h后分别离心取上清液，另设空白对照孔和待测样品孔，待测样品孔中加入上述六组上清稀释液（按1:5稀释）及酶标试剂，空白对照孔加相同体积的蒸馏水，温育、洗涤后加入显色剂及终止液，按序测量各孔的吸光度值，以标准物的浓度和吸光度值计算出标准曲线的直线回归方程式，计算出待测样品的浓度，再乘以稀释的倍数5，即为待测样品的实际浓度。

表1 Samd2、Samd3、Samd4、Samd7引物序列、退火温度和扩充片断

1.2.5QRT-PCR 测定 Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA相对表达量上述六组处理24h后，洗涤细胞提取总RNA并检测浓度和质量，而后立即对其进行反转录操作，扩增反应条件如下：预变性：95℃，30s；40 个循环（95℃，10s，60℃，30s）；溶解曲线：从55℃开始，每30s升高0.5℃，直到95℃，循环1次。所有反应信息资料由PCR仪收集，通过计算机软件测量和计算Ct值，以空白对照组为对照，GAPDH为内参基因，由公式2-ΔΔCT计算可得各基因的转录水平。

1.2.6统计学方法应用SPSS17.0软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠肝星状细胞胶原I含量比较与空白对照组比较，TGF-β1干预后HSC-T6的胶原I含量升高（P＜0.05）；与 TGF-β1 模型组比较，沉默 Smad4基因的Smad4 RNAi组及各含药血清组HSC-T6的胶原I含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2各组大鼠肝星状细胞Smad2、3、4、7mRNA表达比较与空白对照组比较，TGF-β1干预下的HSCT6 的 Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；沉默Smads基因后及中药含药血清干预下的HSC-T6细胞Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA相对表达量降低（P＜0.05）。与TGF-β1干预下的模型组比较，沉默Smads基因后及中药含药血清干预下的HSC-T6细胞Smad2、Smad3、Smad4 及 Smad7 mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）。见表 3。

表2 各组大鼠肝星状细胞胶原I含量比较（pg/mL，x±s）

3 讨论

肝纤维化是逆转肝硬化发生发展的重要过渡期，目前研究表明，肝纤维化的最终共同通路均是由HSC所调节的[7-8]，Bansal[9]认为HSC的纤维化发展与其细胞的异质性及微环境有关，故通过阻断介导HSC由静止状态转变成活化状态的信号通路而改变细胞微环境，是肝纤维化治疗的重要切入点。王宇涵等[10-11]在研究中指出TGF-β1是促进HSC激活及增殖必需的生物调节因子，Smads又是TGF-β1的重要作用底物[12-13]，可见TGF-β1/Smads信号通路对HSC的活化增殖及肝纤维化的发生发展有重要影响。其中Smad蛋白家族成员分为三类，分别为受体型Smad（包括 Smadl、2、3、5、8），是 TGF-β 的 I型受体激酶的底物，通用型Smad（Smad4属于此类）和抑制型 Smad（包括 Smad6、7）。在本实验中，与以 TGF-β1干预的模型组作为对照，在沉默Smads4基因后，Ⅰ型胶原合成减少（P＜0.05），Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA 表达下调（P＜0.05），证实阻断 TGF-β1/Smads信号通路可明显抑制肝纤维化。

疏肝健脾活血方以《伤寒论》中桃核承气汤为基础，并结合多年抗肝纤维化的临床实践化裁而成。本研究发现在疏肝健脾活血方含药血清干预下活化的HSC的Ⅰ型胶原合成显著降低，同时Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA相对表达量全面下调（P＜0.05），沉默Smads4基因后得到的实验结果相同。说明疏肝健脾活血方在离体条件下可以延缓肝纤维化的进程，其机制可能与阻断TGF-β1/Smads信号通路有关，但其对抑制型Smad（Smads7）的抑制作用有待进一步深入探讨。