丁婷婷，董欣琪，张瑾,2,，班龙科，王磊

1. 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601 2. 清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室，北京 100084

没有一种污染物是单独存在的，而是以各种形式和浓度共存于环境中的，进而形成了各种各样复杂的混合污染物。混合污染物的联合毒性与相互作用对环境中的生物生存构成了潜在的威胁[1-2]。因此，混合污染物的联合毒性评估是一个挑战性与必要性并存的课题[3]，而合理的试验设计是有效评估联合毒性的首要条件[4-5]。环境毒理学研究中，学者们常用的混合物设计方法主要有析因设计(FD)[6]、固定浓度比射线法(FCRR)[7]和直接均分射线设计法(EquRay)[8]等。其中FD是研究简单混合物毒性的经典方法，因其实验工作量随组分和浓度水平数呈指数增加，而不适于多元混合物毒性的研究。FCRR法是将传统单点毒性评价方法转变为整个浓度-效应曲线(CRC)上评价的设计方法，且适于3个以上组分混合物的设计。然而，FCRR法只选择了一种近似真实的浓度配比，不能全面反映真实环境中混合物的浓度分布。EquRay法是在FCRR法的基础上建立的二元混合物的设计方法，但不适于组分在整个空间浓度配比的多元混合物毒性评估。均匀设计射线法(uniform design ray, UD-Ray)[9]是成功地将FCRR法与均匀设计(uniform design, UD)结合的混合物设计方法，该方法能以尽可能少的工作量有效地探索混合物尤其多元混合物在不同组分浓度空间配比的毒性变化情况[9]。

除了合理的实验设计，合适的联合毒性评估方法也很重要。目前，关于联合作用评估的经典方法主要有等效线图法(Isobolograms)[10]、毒性单位法(TU)[11]、加和指数法(AI)[12]和混合物毒性指数法(MTI)[13]等。但这些指数方法只研究了混合物体系在某一个特殊效应浓度(通常为50%效应时的浓度)的毒性作用情况，不能表征整个混合物体系。浓度加和模型(concentration addition, CA)是在混合物整个CRC上的评估方法，且能用于大多数混合物毒性的评估[14-16]。

越来越多的研究表明，污染物的毒性是随时间逐渐产生并发展的一个动态变化过程，且不同的污染物随时间可能有不同的毒性变化规律[17-18]。如三嗪类除草剂、离子液体、氨基糖苷类抗生素等及其混合物对发光菌青海弧菌Q67的毒性具有明显的时间依赖性，即毒性随着时间的延长而逐渐增加，但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同，有的污染物甚至出现了明显的浓度-效应曲线(CRC)类型的转化，即从J型转变成S型[19]。王猛超等[15]的研究发现农药三嗪类除草剂及其混合物具有明显的时间依赖性。Zhang等[20]研究发现氨基糖苷类抗生素及其混合物对发光菌具有明显的时间依赖毒性。这表明污染物的毒性除与浓度相关外，与暴露时间也密切相关。因此，仅依据污染物在某一特殊暴露时间点的浓度-效应数据已不能说明实际环境体系的真实情况，必须全面系统采集这些污染物在不同暴露时间对暴露生物的毒性数据，并进行联合毒性作用随时间逐渐变化的动态规律分析，才能揭示污染物间发生毒性相互作用的机制，才能客观准确评价环境污染物的潜在风险[21-22]。

氨基糖苷类抗生素(AG)是一类广泛应用于抗革兰氏阴性细菌活性的广谱性抗生素，因其低成本和高疗效，在发达国家广泛应用于治疗囊性纤维化患者和早产儿，以及各种严重或顽固的细菌感染，包括结核病[23]。然而，许多AG抗生素因具有较高的水溶性，很容易进入水体，进而威胁到水生生物甚至人类的健康和生存[20]。在水生生态系统中，绿藻和细菌是食物链的2个重要的环节，分别位于位于食物链的顶端和末端，在生态系统中扮演着生产者和分解者的角色。因此，开展AG抗生素对生态系统中2种模式生物绿藻和细菌具有重要的实际环境意义。而目前关于AG抗生素对水生生物的在某一特殊暴露时间点的毒性已有报道[18,24]，而关于AG类抗生素的毒性及其联合毒性相互作用(协同或拮抗作用)随暴露时间变化的分析则更少[20,25]。

因此，本文拟以广泛应用的3种氨基糖苷类抗生素：硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、双氢链霉素(dihydrostreptomycin, DIH)和硫酸链霉素(streptomycin sulfate, STS)为研究对象，以水生生态系统中生产者绿藻如蛋白核小球藻(CP)和分解者细菌如发光菌青海弧菌Q67为受试生物，采用UD-Ray法设计三元混合物体系(共安排5条具有不同浓度配比的混合物射线)，应用时间依赖微板毒性分析方法(t-MTA)系统测定抗生素及其混合物射线在不同暴露时间分别对2种指示生物的毒性效应，采用CA模型分析AG抗生素在不同暴露时间的联合毒性相互作用(协同或拮抗作用)，并分析毒性相互作用类型随时间的变化规律，实验结果将为客观、准确地评价抗生素的环境风险提供数据参考。

1　材料与方法(Materials and methods)

1.1　材料、仪器及药品

1.1.1材料

实验菌种青海弧菌Q67 (Vibrio qinghaiensis sp. ─Q67，简称Q67)购自北京滨松光子技术股份有限公司，菌种的培养与保存参照文献[19]。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，简称CP)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，编号为FACHB-5。藻种的培养与保存参照文献[18]。

表1　3种氨基糖苷类(AG)抗生素的基本理化性质Table 1　Basic physicochemical properties of three aminoglycosides (AG) antibiotics

表2　5条抗生素混合物射线的浓度比(pi)Table 2　Concentration ratio (pi) of five anbiotic mixture rays

注：Q67为青海弧菌Q67；CP为蛋白核小球藻。

Note: Q67 stands forVibrio qinghaiensis sp.─Q67; CP stands for Chlorella pyrenoidosa.

1.1.2仪器

实验中用到的主要设备包括Synergy 2酶标仪(美国BioTek伯腾仪器有限公司)、70SW-CJ-IF超净工作台(三发仪器有限公司)、FA1004型五位电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)、YX280A手提式压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)；Genex移液器(10～100 μL)(宝予德有限公司)和BS-2E数显振荡培养箱(上海梅香仪器有限公司)。

1.1.3药品

3种抗生素：硫酸安普霉素(APR)、双氢链霉素(DIH)、硫酸链霉素(STS)均购自上海原叶生物科技有限公司，其理化性质列于表1中。储备液用Mill-Q水配制，并于4 ℃冰箱中保存、备用。

1.2　混合物设计

为系统考察混合物的毒性随浓度和时间的变化规律，应用均匀设计射线(UD-Ray)[9]法设计3种抗生素三元混合物体系5条射线(R1, R2, …, R5)，每条混合物射线的组分及其浓度配比pi值列于表2中。

1.3　时间毒性测试

抗生素及其混合物对发光菌和绿藻的时间毒性测定分别采用基于青海弧菌Q67[20]和蛋白核小球藻CP[18]的时间毒性微板分析法(t-MTA)。对于发光菌，采用不透明的96孔白板作为实验暴露载体，而对于绿藻则采用透明的96孔微板作为实验载体。微板设计方法：在微板4周共36个孔各加入200 μL水防止产生边缘效应。余下的60个孔第2、6、7及11列共24个孔中分别加入100 μL纯水作为空白对照，第3列共6个孔以及第8列共6个孔分别加入按稀释因子设计的12个不同浓度的毒物100 μL，第4和5列为第3列的平行实验以及第9和10列为第8列的平行实验，然后在60个孔中均加入100 μL已培养至对数生长期的发光菌液或绿藻溶液，使各孔中的试液总体积为200 μL，每个浓度至少重复3块板。

对于加入发光菌的微板，则置于恒温培养箱中(22±1) ℃的生化培养箱中培养，并在暴露时间为0.25 h、2 h、4 h、8 h、12 h时取出并置于读板机中测定其发光强度，并计算微板中各个孔中不同浓度的毒物对发光菌的发光抑制率[20]。

对于加入绿藻的微板，则置于温度(22±1) ℃、光强为5 000 lux的光照条件下的光照培养箱中培养，并在暴露时间为12 h、24 h、48 h、72 h、96 h时取出，并置入美国Biotek微板光度计中测定其光密度OD690的值，并计算微板各个孔中不同浓度的毒物对绿藻的生长抑制率[18]。

1.4　时间毒性数据处理与拟合

为了揭示不同暴露时间、不同浓度污染物对发光菌或绿藻的毒性变化规律，采用两参数非线性函数Weibull(1)和Logit(2)对不同时间节点的浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，拟合相关系数(correlation coefficient，简称R)与均方根误差(root mean square error, RMSE)最小者为最优[26]。2个用于描述实验毒性数据的非线性函数公式如下：

E=1/(1+exp(-α-β log10(c)))

(1)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(2)

式中α、β是Weibull和Logit的位置与斜率参数，E为效应即污染物对发光菌的发光抑制率或对绿藻的生长抑制率；c是污染物的浓度。

1.5　混合物毒性相互作用分析

用于混合毒性评估参考模型CA见公式(4)[16]，当观测毒性大于加和参考模型预测毒性时称混合物产生协同作用，小于预测毒性时则称有拮抗作用，若等于预测毒性则称为无相互作用或加和作用。

(3)

式中ci表示混合物中产生某一效应x%时组分i的浓度，ECx,i表示混合物中第i个化合物单独存在时所产生的效应与混合物总效应x%相同时的浓度，E(cmix)表示混合物产生的总效应，E(ci)表示表示混合物中第i个化合物单独存在时所产生的效应。

2　结果(Results)

2.1　3种AG抗生素对发光菌和绿藻的时间依赖毒性

3种AG抗生素在不同时间节点的浓度-效应数据(点)以及通过非线性最小二乘拟合方法的拟合结果列于表3中，其浓度-效应曲线绘于图1中。

从表3可看出，Logit函数能较好地拟合3种抗生素对发光菌Q67和绿藻CP在不同暴露时间的浓度-效应数据，拟合相关系数R除在开始的个别暴露时间点均在0.9以上，均方根误差RMSE小于0.9。从图1可看出，3种抗生素对2种指示生物的浓度-效应曲线(CRCs)均是随暴露时间延长从下至上依次排列，表明3种抗生素的毒性均具有明显的时间依赖毒性，即随着暴露时间的延长，3种抗生素对2种指示生物的毒性逐渐增强。但不同抗生素对于同一种指示生物发光菌或绿藻的毒性随暴露时间的延长变化规律不同，如抗生素APR和DIH对发光菌在0～2 h内，没有明显毒性，但2 h后，毒性迅速增强，8 h后毒性增强缓慢；而STS对2种指示生物的毒性从暴露开始就逐渐增强，在2 h增加速率最快，此后开始变缓。以半数效应浓度的负对数值(pEC50值)为毒性大小指标，3种抗生素对于Q67和CP在暴露时间分别为12 h和96 h时的毒性大小顺序均为：STS > DIH > APR (表3)，但2种水生生物对3种抗生素及其混合物的响应不同，总的来说发光菌的灵敏度要高于蛋白核小球藻(图1和表3)

表3　3种抗生素对Q67和CP的浓度-效应数据Logit拟合的参数、统计量、半数效应浓度及其负对数值Table 3　The parameters of fitting function Logit, statistics, median effect concentration (EC50) and its negative logarhim for the three antibiotics’ concentration-response data towards Q67 and CP

注：α、β为拟合参数；RMSE和R分别是均方根误差和拟合相关系数；EC50为半数效应浓度；pEC50为EC50的负对数。

Note:α, β are fitting parameters; RMSE and R are root mean square error and fitting correlation coefficient, respectively; EC50is median effect concentration; pEC50is -logEC50.

2.2　AG抗生素三元混合物对发光菌和绿藻的时间依赖毒性

采用UD-Ray法设计的三元混合物体系的5条射线分别对2种指示生物在不同暴露时间的拟合，结果绘于图2中。图2显示CRC与单个物质的毒性具有类似的时间依赖性。

图3是5条混合物射线分别对Q67和CP的pEC50值随时间的变化曲线图。从图3可以看出，3条混合物射线对Q67的pEC50值均随暴露时间的延长而单调增加，且增加的趋势相似，但3条混合射线对CP的pEC50值随时间单调增加的规律不同，R1和R3在72 h才达到50%的抑制率，而其余3条射线则是在48 h达到50%的抑制率。图2和图3也显示，2种指示生物对AG抗生素的三元混合物体系的毒性响应有差异，发光菌的响应比绿藻的灵敏。

2.3　AG抗生素混合物的时间依赖毒性相互作用

三元混合物的5条射线对Q67和CP的浓度-效应数据点及其CRC曲线以及CA预测结果绘于图4中和图5中(由于在开始的2个时间点，所有的混合物射线都没有明显的毒性，故图4和图5中没列出)。

图1　3种抗生素对Q67和CP在不同暴露时间的浓度-效应曲线(CRCs)Fig. 1　Concentration-response curves of three antibiotics at different time points for Q67 and CP

图2　三元混合物射线不同时间节点对Q67和CP的CRCs关系Fig. 2　The CRCs of ternary mixture rays at different exposure times for Q67 and CP

图4显示，所有混合物射线的CA预测线基本上都在实验观测CRC的置信区间内，且几乎与实验观测CRC重叠，表明CA能很好地预测所有混合物射线在不同暴露时间对发光菌的毒性，即3个抗生素的三元混合物对青海弧菌Q67的毒性呈经典的加和作用，且不随暴露时间的延长和浓度的增加而发生变化。图5显示三元混合物的5条射线中，CA对R2、R3和R4的预测线也落在实验观测CRC的置信区间，即3条射线也为加和作用，且不随暴露时间和暴露浓度的变化而变化。而CA对R1和R5的预测线在72 h和96 h落在了观测CRC的上方，表明2条射线在这2个暴露时间点的毒性呈现拮抗作用，且随暴露时间的变化而变化，其中R1在暴露时间48 h呈加和作用，在72 h则呈明显的拮抗作用，然后拮抗作用开始减弱；R5则从48 h的加和作用，变化为96 h的弱拮抗作用，2条射线的拮抗作用均发生在中浓度区。

3　讨论(Discussion)

越来越多的研究表明部分污染物具有明显的时间依赖毒性，但不同的污染物具有不同的时间毒性变化规律[18, 27]。本研究中的3种抗生素及其三元混合物射线对2种指示生物的毒性均表现出明显的时间依赖性，但不同抗生素对于指示生物的毒性随暴露时间的延长变化规律不同。因此在进行污染物生态毒性评价时应同时考虑浓度与时间2个因素[18]，才能全面了解污染物的毒性效应，更深入地了解污染物的毒性作用机制与途径。

不同的水生生物对同一种化合物或混合物的毒性响应可能不同[28]。因此，本研究比较3种抗生素及其混合物对2种指示生物发光菌和绿藻的毒性，结果如图1和表3显示，2种水生生物对3种抗生素的响应不同，发光菌的灵敏度要高于蛋白核小球藻。这可能是由于绿藻的毒性指标为生长抑制率，是通过测定藻溶液在某一特定波长的吸光度值来计算得到的，实验中死亡的藻细胞可能对结果有一定的影响，而发光菌的毒性指标为发光抑制毒性，通过计算暴露前后发光菌的发光值而得到的，受损或死亡的菌体发光很弱或不发光，而对于菌落的发光值影响很小。冯晓娜等[29]也研究发现有机污染物对不同模式生物的毒性有差异，对发光菌的毒性明显高于对鱼的毒性。

混合物的毒性相互作用可能具有浓度或浓度比依赖性[30]。因此，为了解混合物组分在整个空间浓度配比的相互作用情况，混合物的设计显得极其重要的。在混合物的设计方法中，UD-Ray[9]是将简单的混合物联合毒性研究推向真正的多组分的复杂混合物领域，且能以最少的实验工作最有效地考察具有各种组分浓度空间配比的混合污染物的联合毒性。因此，在本研究中，采用均匀设计射线法(UD-ray)，设计了一组三元混合物体系共计5条具有不同组分浓度配比的混合物射线，并应用时间毒性微板分析法系统测定了5条混合物射线分别对2种指示生物在不同暴露时间的联合毒性数据。结果显示具有不同浓度配比的混合物射线对发光菌Q67呈经典的加和作用。Zhang等[20]的研究也发现氨基糖苷类抗生素二元混合物对发光菌Q67在不同暴露时间的毒性均呈经典的加和作用。但三元混合物体

图3　三元混合物射线的pEC50值随时间变化曲线Fig. 3　The changing curves of pEC50 values with the time for the ternary mixture rays

系APR-DIH-STS的5条射线对蛋白核小球藻CP的毒性，既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用随暴露时间和暴露浓度的变化而变化。这表明抗生素联合毒性相互作用与指示生物和暴露时间有关。Liu等[28]也报道同一组混合物可能对不同的指示生物呈现出不同甚至是截然相反的毒性相互作用类型。

图4　三元AG抗生素混合物体系对Q67的实验观察浓度-效应数据及其95%置信区间以及CA预测结果注：图中黑色分散的点(·)，实验点；黑色实线(—)，拟合线；红色虚线(---)，CA预测线；蓝色虚点线(--)，95%置信区间；下同。Fig. 4　The observed concentration-response data together with their 95% confidence intervals and predicted curves by CA for the ternary AG antibiotic mixture systems towards Q67Note: The black dispersed point, black solid line, red dash line and the blue dash dot line in figure refer to the observed data, fitted line, CA prediction line and 95% confidence interval, respectively; the same below.

同一指示生物CP，UD-Ray设计的不同浓度配比射线的毒性相互作用也不相同，有的射线呈加和作用，而有的射线呈拮抗作用，且不同射线，拮抗作用的程度不同，AG抗生素毒性及其联合毒性相互作用与暴露的生物、混合物组分的浓度配比、暴露时间等有关。同时表明，UD-Ray法与固定组分浓度配比的FCRR法和FD相比，更适于多组分混合物联合毒性作用的研究。

综上，3种AG抗生素APR、DIH和STS及其三元混合物射线对2种指示生物发光菌Q67和蛋白核小球CP具有明显的时间依赖毒性，但Q67对3种抗生素及其混合物射线的响应比CP的灵敏。以半数效应浓度的负对数pEC50值为毒性大小指标，3种AG抗生素对2种指示生物的毒性大小顺序随暴露时间而变化，对于Q67和CP在暴露时间分别为12 h和96 h时的毒性大小顺序均为：STS > DIH > APR。5条具有不同组分浓度配比的AG抗生素混合物射线对Q67在不同暴露时间的毒性均呈加和作用，但对CP的毒性既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用具有浓度比依赖性和时间依赖性，表明AG抗生素毒性及其联合毒性相互作用与暴露的生物、混合物的浓度、组分的浓度配比、暴露时间等有关。

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