钟华,董洁,董宽虎*

(1.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801；2.北京市科学技术情报研究所，北京 100044)

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是豆科苜蓿属植物，又名花苜蓿、野苜蓿、扁豆子、扁豆草、扁蓄豆、网果葫芦巴等[1]，具有抗干旱，耐盐碱，耐瘠薄，耐寒冷，产量高，叶量丰富和适应性强等优点，是我国北方分布较广的牧草之一[2]。目前对扁蓿豆抗性的研究多集中于其抗旱性，耐盐性研究较少，主要是通过盐胁迫下扁蓿豆种子萌发、幼苗生长及生理响应等评价其耐盐性差异，而对脯氨酸合成和降解关键酶在盐胁迫过程中的变化研究较少[3-9]。

脯氨酸是分布广泛的一类渗透调节物质，植物在逆境胁迫条件下可以通过增加合成、减少降解而在体内累积大量脯氨酸，这对于防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义[10]。植物体内脯氨酸的积累与其合成和降解有关，鸟氨酸(Orn)途径和谷氨酸(Glu)途径是植物体内脯氨酸合成的两条重要途径，而这两种途径则因物种不同、生境变化等因素而有所差异[11]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ氨基转移酶(δ-OAT)分别是Glu途径和Orn途径的关键酶。脯氨酸脱氢酶(ProDH)是脯氨酸降解过程中的限速酶[12]。

本试验采用盐碱化草地上的野生扁蓿豆种子，在不同浓度梯度的不同盐(中性盐、碱性盐)胁迫下，对其脯氨酸积累及代谢关键酶活性进行研究，以期为扁蓿豆耐盐性研究及抗盐育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 种子来源

试验用扁蓿豆种子于2009年秋季采自山西省右玉县威远镇后所堡的盐碱化草地(112°19′17.6″ E，39°59′17.0″ N，海拔1340 m)，保存于山西农业大学草业科学系种质资源库。

1.2 试验方法

试验于2010年，在山西农业大学草业科学实验室日光温室内进行，温室平均温度为20～25 ℃，相对湿度为65%～75%。试验采用盆栽法，盆口内径25 cm、高20 cm，装入2∶1的蛭石与珍珠岩(V/V)，插入PVC管以便浇水及营养液。选取大小均等、籽粒饱满的扁蓿豆种子直接播种，播种量50粒/盆，共播种39盆。出苗后隔天浇灌Hoagland营养液，其他时间定期浇水以平衡蒸发量。出苗6周后开始盐胁迫处理。本实验的盐胁迫处理分别为NaCl、Na2CO3溶液，各设7个浓度，即0(CK)、50、100、200、300、400、500 mmol·L-1，每个处理3个重复。蒸发量以称重法确定，每天按50 mmol·L-1的浓度梯度进行递增，直至达到指定的浓度为止。胁迫一周后取样，保存于-80 ℃冰箱中待测。

1.3 测定指标

脯氨酸(Pro)含量的测定采用酸性茚三酮比色法[13]；吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的提取与活性测定参照文献[14-15]的方法进行；鸟氨酸-δ氨基转移酶(δ-OAT)的提取与活性测定参照文献[16-17]的方法进行；脯氨酸脱氢酶(ProDH)的提取与活性测定参照Lutts等[18]的方法进行。

1.4 数据处理

采用Excel 2010进行数据处理，采用SPSS 18.0软件进行ANOVA方差分析，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对扁蓿豆叶片和根系Pro含量的影响

NaCl和Na2CO3胁迫下，扁蓿豆根系和叶片中Pro含量均随浓度的增加而呈先升后降的趋势，并均在盐浓度400 mmol·L-1时达到最大值(表1)。在不同浓度NaCl胁迫下，当NaCl浓度≥100 mmol·L-1时，扁蓿豆叶片中Pro含量均高于根系；而不同浓度Na2CO3胁迫下，扁蓿豆叶片中Pro含量均低于根系。

2.2 盐胁迫对扁蓿豆叶片和根系P5CS活性的影响

NaCl胁迫下，扁蓿豆根系和叶片中P5CS活性均随浓度增加而升高(表2)。Na2CO3胁迫下，扁蓿豆根系和叶片中P5CS活性除在浓度为50 mmol·L-1时与CK差异不显著(P>0.05)外，均随盐浓度增加而升高，在浓度为500 mmol·L-1时达到最高。在相同盐的同一胁迫浓度下，叶片中P5CS活性均高于根系。

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Means in the same column with different small letters are the significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同盐胁迫下扁蓿豆P5CS活性的变化Table 2 Changes in P5CS activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 protein)

2.3 盐胁迫对扁蓿豆叶片和根系δ-OAT活性的影响

NaCl胁迫下，扁蓿豆叶片中δ-OAT活性随浓度增加而升高，而根系中δ-OAT活性则随浓度增加呈先升后降的趋势，浓度为400 mmol·L-1时显著(P<0.05)高于其他浓度；且在相同浓度胁迫下，扁蓿豆叶片中δ-OAT活性普遍高于根系(表3)。Na2CO3胁迫下，扁蓿豆叶片和根系中δ-OAT活性均随浓度增加呈先升后降的趋势，浓度为400 mmol·L-1时显著(P<0.05)高于其他浓度；且在浓度为200～400 mmol·L-1时，扁蓿豆根系中δ-OAT活性高于叶片。

表3 不同盐胁迫下扁蓿豆δ-OAT活性的变化Table 3 Changes in δ-OAT activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 protein)

2.4 盐胁迫对扁蓿豆叶片和根系ProDH活性的影响

NaCl和Na2CO3胁迫下，扁蓿豆根系和叶片中ProDH活性均随浓度增加而降低(表4)。在NaCl胁迫下，当盐浓度达到200 mmol·L-1时，扁蓿豆叶片和根系中ProDH活性显著降低(P<0.05)。在Na2CO3盐浓度300 mmol·L-1时，扁蓿豆根系中ProDH活性显著降低(P<0.05)。在相同盐的同一浓度胁迫下，扁蓿豆根系中ProDH活性均高于叶片。

表4 不同盐胁迫下扁蓿豆ProDH活性的变化Table 4 Changes in ProDH activity in M. ruthenica under different salinity stresses (U·mg-1 FW)

3 讨论

3.1 盐胁迫对扁蓿豆幼苗Pro含量变化的影响

在逆境条件下，植物往往通过产生渗透调节物质来形成适应性反应，因此，渗透调节物质的积累是植物适应逆境胁迫的基本特征之一。脯氨酸的积累可以增加植物对渗透胁迫的耐性，提高其抗胁迫能力[19]。本研究结果表明，在不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫下，扁蓿豆幼苗根系和叶片中Pro含量均随浓度增加而显著(P<0.05)升高，这说明扁蓿豆幼苗通过根系和叶片中积累Pro来缓解盐胁迫损伤。然而，NaCl和Na2CO3胁迫对其根系和叶片中Pro积累的影响存在差异。NaCl胁迫下，叶片中Pro含量高于根系，这与在菊苣(Cichoriumintybus)[12]中的结果一致；而Na2CO3胁迫下，根系中积累的Pro含量高于叶片，这与在梭梭(Haloxylonammodendron)[20]及沙棘(Hippophaerhamnoides)[21]等植物的研究结果相似，即植物受到碱性盐的伤害作用大于中性盐。NaCl和Na2CO3浓度为400 mmol·L-1时，扁蓿豆叶片和根系中的Pro含量显著高于其他浓度，说明此时扁蓿豆对这两种盐胁迫的耐受性最强，盐浓度继续增加将导致扁蓿豆幼苗渗透调节系统紊乱，因此，扁蓿豆承受NaCl和Na2CO3胁迫时浓度不宜超过400 mmol·L-1。

3.2 盐胁迫对扁蓿豆幼苗Pro代谢关键酶活性变化的影响

盐胁迫下，植物体内Pro代谢关键酶活性变化直接决定着Pro的合成和分解代谢。本试验中扁蓿豆根系和叶片中P5CS和δ-OAT活性均随NaCl和Na2CO3浓度的增加而升高，而ProDH活性随NaCl和Na2CO3浓度的增加而降低，这说明盐胁迫条件下扁蓿豆叶片和根系内Pro含量升高是主动积累(合成代谢的加强和分解代谢的抑制)的结果，这与Kavi等[22]的研究结果相似。扁蓿豆根系和叶片中P5CS和δ-OAT活性的增强，表明其Pro合成代谢的加强，而ProDH活性降低则表明其Pro分解代谢受到抑制，这表明扁蓿豆受到了外界胁迫[23]，这与孙聪聪等[24]、董秋丽等[25]的研究结果相一致。

盐胁迫下，植物体内P5CS活性会受到Pro反馈调节，而δ-OAT活性则不受Pro反馈抑制[26]。赵福庚等[27]研究表明，盐胁迫会激活Pro合成的Glu途径和Orn途径，NaCl浓度为200 mmol·L-1时，大麦(Hordeumvulgare)的Pro合成途径由Glu途径为主逐渐转变为以Orn途径为主，临界浓度则因植物种类及植物对盐胁迫的敏感程度而异。本试验中，NaCl和Na2CO3胁迫下，P5CS和δ-OAT活性升高，且高浓度胁迫下显著高于CK，这说明NaCl和Na2CO3胁迫下扁蓿豆Pro合成是Glu途径和Orn途径共同作用的结果。然而，NaCl和Na2CO3浓度为500 mmol·L-1时，扁蓿豆根系和叶片中Pro含量已显著(P<0.05)下降，其P5CS活性却仍显著(P<0.05)升高，而其δ-OAT活性显著(P<0.05)下降，这说明扁蓿豆根系和叶片中Pro积累受Orn途径变化影响最大，所以NaCl和Na2CO3胁迫下扁蓿豆根系和叶片中Pro积累以Orn途径为主。这与NaCl和Na2CO3胁迫下菊苣[12]、裸燕麦(Avenanuda)[28]、银杏(Ginkgobiloba)[24]和碱地风毛菊(Saussurearuncinata)[29]等植物幼苗脯氨酸代谢的研究结果相似。

4 结论

NaCl和Na2CO3胁迫下，扁蓿豆幼苗通过提高其Pro含量以缓解渗透胁迫造成的伤害。扁蓿豆幼苗内Pro含量的升高是主动积累的过程，并由Glu途径和Orn途径共同作用的结果，但以Orn途径为主。扁蓿豆所承受的NaCl和Na2CO3浓度不宜超过400 mmol·L-1。

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