2种提取野生蕈菌DNA方法的比较及其应用

2018-04-18何山文雷琼马立安

长江大学学报(自科版) 2018年6期

关键词：方法

何山文雷琼马立安

( 长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025)( 湖北省荆州市文物保护中心，湖北荆州 434020)( 长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025)

传统的真菌鉴定多以形态学为依据，存在不确定性，对于少见真菌诊断困难。随着分子生物学技术的发展，真菌可鉴定至种的水平。目前实验室对于难鉴定的真菌多采用PCR扩增结合测序分析的方法[1]，该法具有准确、简单、快速、实用性强的特点，而进行PCR扩增首先需要提取真菌基因组DNA，因此探索出快速、高效、安全的真菌基因组DNA抽提法显得尤为重要。

目前提取真菌DNA的方法较多，包括十六烷基三甲基溴化铵( CTAB)法[2]、十二烷基磺酸钠( SDS)法[3]、氯化苄法[4]等，但不同真菌类群适用的方法可能存在一定差异[5]。本研究通过改良的CTAB法和SDS-CTAB法提取真菌子实体DNA并进行比较，以期获得一种高效、高质地提取真菌子实体DNA的方法，应用于野生蕈菌的分类鉴定。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1样品

供试野生蕈菌4#、6#、8#、16#、18#、19红、22#、26#、30B#、34#、36#、37#、48#、51#、60#、61#等样品在2012年8月采集于英国诺里奇东英吉利亚大学校区附近，样品子实体在恒温鼓风干燥箱50℃烘干，粉碎保存于长江大学生命科学学院实验室。其中DNA提取方法的比较试验所用样品为4#样品。

1.1.2主要试剂

Taq酶、Goldview核酸染料、PCR相关试剂和DL2000 DNA Marker等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；上游引物ITS5和下游引物ITS4，由生工生物工程( 上海)股份有限公司合成。

2% CTAB提取液：20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA( pH 8.0)，100mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

1% CTAB沉淀液：10g/L CTAB，10mmol/L EDTA( pH 8.0)，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

2% SDS提取液：20g/L SDS，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，1.4mol/L NaCl ，50mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

5% CTAB沉淀液：50g/L CTAB，1.0mol/L NaCl，50mmol/L EDTA( pH 8.0)，250mmol/L Tris-HCl( pH 8.0)。

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA( pH 8.0)。