卢煜 贾立昕 张文美 杜杰 解军

急性心肌梗死是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死[1-2］。心脏重构对心肌梗死远期预后具有重要意义，巨噬细胞参与心肌梗死后心脏重构的全过程[3］。在不同刺激下，巨噬细胞可分化为M1型(经典活化型)和M2型(替代活化型)型两种表型[4］发挥不同的作用：M1型巨噬细胞主要发挥促炎/杀菌等作用，M2型巨噬细胞则主要表现为抑炎及促修复等作用[5］。但转录因子IRF5是巨噬细胞极化的主要调节因子[6-7］，外源性IRF5可以上调M1型或下调M2型巨噬细胞表型标记物的表达[8］，但是IRF5是否参与心肌梗死后心脏重构的作用和机制尚不完全清楚。本研究通过构建小鼠心肌梗死模型，以及体外缺氧/复氧刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞研究IRF5对小鼠心肌梗死后心脏重构的影响及其可能的作用机制。

材料与方法

1.实验动物与分组 实验所用8周龄，雄性，C57BL/6J小鼠，全部购买自华阜康生物科技有限公司，饲养于北京市心肺血管疾病研究所SPF级动物房。将30只，8周龄，雄性小鼠，随机分为两组：假手术组(n=15)和心肌梗死手术组(n=15)。

2.小鼠心肌梗死模型 用1%～2%异氟烷和氧气混合气体麻醉小鼠，在第四肋间间隙经开胸挤出心脏后，用6-0尼龙单丝缝线永久性结扎冠状动脉左前降支，用4-0线缝合胸腔，等待小鼠自然苏醒。假手术组不结扎冠状动脉前降支，其余操作与观察组一致。心肌梗死模型构建由专业人员在同一地点完成，保证模型复制的一致性。

3.小鼠心功能检测 心肌梗死后7d利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System进行超声心动图检测。将小鼠麻醉后仰卧位固定小鼠，心率维持在450～550次/min，在二维模式下获得胸骨旁长轴和心室中短轴图像，记录乳头肌水平的M型轨迹。使用Visual Sonics Vevo 2100软件离线进行图像分析。

4.心脏组织病理切片制备及染色 小鼠心肌梗死7d后，用含肝素的0.9%氯化钠溶液灌注心脏，去除心脏内血液，用10%甲醛固定后用石蜡包埋，每隔5μm切片。根据制造商(雷根公司)产品说明书进行Masson染色，检测心脏纤维化水平。免疫组化染色是将石蜡切片(5μm)脱蜡并抗原修复后用5%BSA封闭然后用一抗 IRF5(ab33478，Abcam)、MAC-2(sc20157， Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育过夜。次日用二抗(anti-mouse IgG)与一抗反应，常温孵育1h。所有图像用NIS-Elements BR 3.0软件进行分析。

5.小鼠骨髓来源巨噬细胞提取及处理 从8周龄，雄性C57BL/6J小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓，过70μm尼龙筛网过滤器，1 500rpm，5min离心后用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，加入集落刺激因子M-CSF(Pepro Tech)，在37℃含5%二氧化碳和95%氧气的细胞培养箱中培养3d。siRNA转染巨噬细胞是采用 LipofectamineTMiMAX转染试剂将50nM的IRF5 siRNA或control siRNA转染至巨噬细胞。缺氧/复氧刺激是将细胞在37℃含5%二氧化碳和无氧气条件下培养8h，然后在常氧条件下继续培养12h。

6.实时荧光定量PCR 用Trizol试剂(Invitrogen)从小鼠心脏组织及体外培养的细胞中提取总RNA，每份样品用反转录试剂盒(Promega)将2μg RNA反转录成cDNA。然后每份样品取1μL cDNA用10μL SYBR Green PCR Master Mix和1μmol/L primers进行扩增。实时荧光定量PCR用CFX-96实时定量PCR仪进行检测，实验使用相关引物序列如下：IRF5，上游 5'-GGTCAACGGGGAAAAGAA ACT-3'，下游 5'-CATCCACCCCTTCAGTGTACT-3'；iNOS，上游 5'-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3'，下游 5'-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3'；IL-1β，上游 5'-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3'，下游5'-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3'；IL-6，上游 5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，下游 5'-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；GAPDH，上 游 5'-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGA-3'，下游 5'-TTGAAGTCACAGGAGACAACCTGG-3'。

7.流式细胞术 假手术组和心肌梗死小鼠心脏组织炎症细胞浸润水平通过流式细胞术来检测。取两组小鼠心脏组织，切碎，用collagenase II和 Dispase II在37℃条件下消化30min。实验使用的相关抗体包括：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD45.2、PE抗小鼠F4/80、Alexa APC抗小鼠 CD11b、FITC抗小鼠CD206。

8.统计学数据分析 应用GraphPad-Prism 7.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.心肌梗死后小鼠存活情况和心功能变化 取30只，8周龄，雄性，C57BL/6J小鼠，随机分为假手术组(n=15)和心肌梗死手术组(n=15)。统计两组小鼠存活率：假手术组15只小鼠全部存活，存活率100%(15/15)；心肌梗死组分别在第3天死亡1只、第5天和6天各死亡2只，存活率66.7%(10/15)，心肌梗死组小鼠存活率明显低于假手术组(图1A)。利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System进行超声心动图检测，从表1结果可见：假手术组和心肌梗死组小鼠室间隔(IVS)、LVIDD、LVIDS、左心室收缩期心室后壁厚度(LVPWS)、EF和缩短分数(FS)均有明显差异(P＜0.05)。由表2结果可见：与假手术组相比，心肌梗死术后小鼠体质量无明显差异，HW/BW明显增加[(5.31±0.17)vs.(7.25±0.73)mg/g，P＜0.05］。 以上结果表明：心肌梗死术后7d小鼠存活率降低，心功能降低，心脏结构也发生改变。

表1 两组小鼠超声心动图测定结果(¯±s)

表1 两组小鼠超声心动图测定结果(¯±s)

项目 Sham(n=15) MI(n=15)IVSd/mm 0.99±0.08 0.85±0.29 IVSs/mm 1.50±0.10 1.03±0.22*LVID d/mm 3.47±0.21 4.36±0.91*LVID s/mm 2.08±0.21 3.83±1.03*LVPW d/mm 0.80±0.09 0.77±0.16 LVPW s/mm 1.17±0.19 0.92±0.18*LVEF/% 72.72±3.55 29.77±6.63*LVFS/% 41.53±2.64 14.63±5.44*LV Mass(Corrected)/g 91.34±2.98 108±18.03

表2 两组小鼠体质量、心脏质量/体质量测定结果(¯±s)

表2 两组小鼠体质量、心脏质量/体质量测定结果(¯±s)

项目 Sham(n=15) MI(n=15)BW/g 27.30±0.99 26.66±0.82 HW/BW/(mg/g) 5.31±0.17 7.25±0.73*

2.心肌梗死后小鼠心脏纤维化加重 心肌梗死7天后，用0.9%氯化钠溶液进行灌流后进行病理检测。通过Masson染色观察心脏纤维化水平，统计结果表明，与假手术组相比，心肌梗死组小鼠心脏纤维化水平明显增加[(0.90±0.29)%vs.(24.54±5.43)%］(图1B)。

3.心肌梗死后心脏组织巨噬细胞表型分析 首先我们对假手术组和心肌梗死术后7天小鼠心脏组织进行了流式细胞术检测，结果表明：与假手术组相比，心肌梗死组小鼠心脏组织CD45+白细胞[(1.90±0.53)vs.(10.05±0.44)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞[(0.77±0.21)vs.(7.70±1.68)%］浸润明显增多，并且 CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬细胞[(0.43±1.52)vs.(4.47±0.45)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬细胞[(0.33±0.06)vs.(3.13±0.60)%］也明显增加(图2A)。通过MAC2免疫组化染色进一步说明心肌梗死后巨噬细胞浸润增加[(2.25±1.89)vs.(96.5±7.90)%］(图2B)。 接下来我们通过实时荧光定量PCR检测了心肌梗死7天后心脏组织中M1型巨噬细胞标志物iNOS、IL-1β、IL-6的表达情况，统计结果表明与假手术组相比，心肌梗死后M1型巨噬细胞标记物表达均明显增加(图2C)。以上结果表明：小鼠心肌梗死术后7d，心脏组织炎症细胞浸润增加，M1型巨噬细胞浸润增加。

图1 心肌梗死对小鼠存活率及心脏纤维化的影响 A：与假手术组相比，心肌梗死7天小鼠存活率明显降低；B：Masson染色评价假手术组和心肌梗死7天小鼠心脏纤维化水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

图2 心肌梗死后心脏组织炎症细胞浸润情况 A：流式细胞术检测假手术组和心肌梗死7天小鼠心脏组织CD45+白细胞、CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬细胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬细胞数占总细胞数比例；B：免疫组化染色检测假手术组和心肌梗死组小鼠IRF5表达；C：使用实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物mRNA表达水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4.心肌梗死后心脏组织IRF5表达升高 为了进一步探索心肌梗死引起M1型巨噬细胞增多的分子机制，我们利用免疫组化染色和实时荧光定量PCR检测了心肌梗死后7d心脏组织中IRF5表达水平，结果表明心肌梗死后 IRF5蛋白表达水平[(2.67±2.08)vs.(76±9.54)%］和RNA表达水平[(1.01±0.18)vs.(12.91±1.34)%］均明显升高(图3)。

5.体外缺氧/复氧刺激促进M1型巨噬细胞极化与IRF5表达 我们利用体外缺氧/复氧刺激构建巨噬细胞缺氧/复氧模型，通过实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物iNOS、IL-1β、IL-6以及IRF5表达，结果表明，与常氧假手术组相比，缺氧/复氧刺激后M1型巨噬细胞标志物表达均明显增加，并且IRF5表达增加[(0.97±0.04)vs.1.28±0.13)%］(图4)。

6.体外抑制IRF5可以降低缺氧/复氧刺激引起的M1巨噬细胞极化 为了进一步探索IRF5与M1型巨噬细胞之间的关系，我们首先检测了IRF5在巨噬细胞中的基因沉默效率，siIRF5处理C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞后，IRF5的mRNA表达水平降低70%(图5A)。接下来我们利用siIRF5处理C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞，缺氧/复氧处理后利用实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物(iNOS，IL-1β，IL-6)表达，结果显示siIRF5转染组中M1型巨噬细胞标志物表达水平与假手术组相比均明显降低(图5B)。以上结果表明：抑制IRF5可以降低缺氧/复氧刺激引起的M1巨噬细胞极化。

讨 论

心肌梗死后导致的心脏重构最终会引起心力衰竭等严重后果[9］，随着医疗水平的不断发展，急性心肌梗死患者早期死亡率明显降低，但是梗死晚期不良的心脏重构，是心肌梗死后心衰等不良预后的重要病理基础[10］。近年来研究发现，炎症反应在心肌梗死后心脏重构过程中发挥重要作用[11］，巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，主要通过吞噬细胞碎片、坏死细胞[12］，以及直接分泌生长因子或细胞因子等方式参与成纤维细胞激活与胶原产生等过程[13-14］。在我们的研究中发现，心肌梗死手术组小鼠心功能显著降低，心脏炎症细胞浸润明显高于假手术组，心脏纤维化面积较假手术组明显增大。提示心肌梗死后炎症因子表达增加，导致心脏炎症和心脏纤维化的加重，恶化心肌梗死后的心脏重构。

图3 心肌梗死后心脏组织IRF5表达水平升高 A：免疫组化染色检测假手术组和心肌梗死组小鼠心脏组织IRF5表达；B：实时荧光定量PCR检测IRF5表达水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

图4 体外缺氧/复氧刺激促进M1型巨噬细胞极化以及IRF5表达水平 A：缺氧/复氧刺激后，利用实时荧光定量PCR检测IRF5在mRNA水平的表达；B：缺氧/复氧刺激后，利用实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物在mRNA水平的表达。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

图5 体外抑制IRF5可以降低缺氧/复氧刺激引起的M1巨噬细胞极化 A：Realtime-PCR法检测siCON和siIRF5处理后的WT小鼠骨髓巨噬细胞IRF5表达水平；B：利用si CON和si IRF5处理WT小鼠骨髓巨噬细胞，缺氧/复氧刺激后，利用realtime-PCR法检测M1型巨噬细胞标志物iNOS、IL-1β、IL-6表达。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

巨噬细胞在不同刺激下分化为M1(经典活化)型和M2(替代活化)型，其中以分泌促炎因子为主，发挥促炎作用的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞，其表面标志物有：iNOS， IL-1β，IL-6，HLA-DR，CD197等，巨噬细胞在脂多糖、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ等刺激因子作用下会极化为具有宿主免疫功能的M1型巨噬细胞。在炎症反应后期发挥抗炎作用并促进组织修复及纤维化的巨噬细胞为M2型巨噬细胞，常见的 M2巨噬细胞表面标志物有：Arg1，CD206， TGF-β等，巨噬细胞在 IL-4、IL-13、M-CSF和TGF-β等作用下向M2型极化[15-16］。M1型和M2型巨噬细胞与心肌梗死后炎症反应和心脏重构有密切关系。M1型巨噬细胞会促进炎症反应，加重组织损伤，M2型巨噬细胞发挥抑制炎症反应并且促进瘢痕形成的作用。Hu等研究发现在小鼠心肌梗死模型中，清道夫受体A缺陷使M1型巨噬细胞极化增加，炎症因子分泌增多，心功能恶化，心室扩张[17］。Pooja等报道指出Caveolin-1敲除通过调节TGF-β信号通路促进M2型巨噬细胞激活加剧小鼠心肌梗死后心肌间质纤维化[18］。Mira等研究表明在小鼠心肌梗死后，IL-10治疗可以增加M2型心脏巨噬细胞极化，减少炎症，增加伤口愈合，防止MI后不良的心脏重构[19］。与上述报道一致，我们的研究中发现小鼠心肌梗死后心脏组织中M1型巨噬细胞表面标志物表达明显增加，心功能恶化，并且在体外缺氧/复氧刺激小鼠骨髓巨噬细胞同样发现M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IL-1β、IL-6)表达的增加。以上结果表明巨噬细胞极化在心肌梗死后炎症反应和心脏重构过程中发挥重要作用。

巨噬细胞的不同分化影响心脏重构及远期心功能，但其分化调控机制仍不完全明确。有报道表明，LPS刺激骨髓来源巨噬细胞使其向M1型分化，这些巨噬细胞的IRF5 mRNA和蛋白高度表达，并分泌促炎细胞因子，并且在抗原诱导的小鼠关节炎模型中同样证明IRF5是M1型巨噬细胞极化的主要调节因子，可以被用作炎症巨噬细胞的可靠标志物[20］。在脊髓损伤小鼠模型中，siRNA介导的IRF5基因敲除导致 M1巨噬细胞标志物表达减少[21］。但在心肌梗死后的心脏重构中，IRF5是否参与调节巨噬细胞分化及重构过程并不清楚。我们的结果表明，在小鼠心肌梗死以及体外缺氧/复氧刺激后，M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IL-1β、IL-6)的表达明显增加，并且IRF5的表达水平也明显增加，给予si-IRF5转染后，M1型巨噬细胞标记物表达水平降低。提示IRF5在心肌梗死后M1型巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。

综上所述，心肌梗死后心肌组织IRF5表达显著上调，伴随着M1型巨噬细胞极化，加重心肌梗死后炎症反应和心脏重构。提示IRF5可以作为调节M1型巨噬细胞极化的主要因子，参与心肌梗死后心脏重构，为深入探讨心肌梗死后的心脏重构的分子机制及治疗提供新的思路。