陈　晨, 李墨非， 孙 黎

(1.中国科学院海洋研究所 海洋生物学重点实验室, 青岛 266071; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

CD80为抗原递呈细胞上一种膜糖蛋白，隶属于免疫球蛋白超家族[1-2]。在免疫系统中，抗原递呈细胞表面的CD80分子和免疫球蛋白超家族中的另一成员CD86与T淋巴细胞表面的配体CD28结合，从而协同刺激T细胞增殖、活化[3]，在机体清除病原体以及体液免疫与细胞免疫过程中发挥重要作用。

关于CD80的功能研究主要集中在哺乳动物中和少数鸟类中[3]。在人类的抗原递呈过程中，CD80通过与辅助T细胞前体细胞(Thp)表面的CD28分子结合，使Thp分化形成辅助T细胞(Th)细胞，Th细胞通过分泌细胞因子增强免疫效应并激活下一步免疫反应[4]。目前在鱼类中关于CD80的报道较少，Zhang等对虹鳟鱼的CD80/86分子进行了克隆鉴定及功能分析，发现CD80/86基因在大肠杆菌脂多糖和弧菌毒素刺激下表达显著上调，且CD80/86能调节IL-2基因的表达，说明CD80/86在抵抗细菌侵染、调控机体免疫反应中起重要作用[3]。Shao等发现斑马鱼树突细胞上存在CD80/86，并具有与哺乳动物中的CD80相似功能[1]。汤菊芬等对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus) CD80分子进行了克隆鉴定，并分析了健康状态及细菌感染后CD80在罗非鱼不同组织中的基因表达情况[5]。但是，在我国经济养殖鱼类半滑舌鳎中，CD80尚未有研究。

半滑舌鳎是中国珍贵的海水养殖鱼类，因味道鲜美、营养丰富深受广大消费者的喜爱，具有很大的市场经济价值。然而，由细菌、病毒引起的疾病给半滑舌鳎养殖业造成了巨大经济损失，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和细胞肿大病毒是引起半滑舌鳎细菌性疾病的主要病原微生物[6-7]。本研究从半滑舌鳎基因组数据库中克隆得到CD80的基因(命名为CsCD80)，检测了CsCD80在健康半滑舌鳎和病原感染的半滑舌鳎不同组织中的表达情况，并且检测了重组表达的CsCD80蛋白与半滑舌鳎外周血淋巴细胞(PBL)的结合能力。

1　材料和方法

1.1　材料

半滑舌鳎购于山东青岛商业化养殖场，暂养于20℃通气海水中2周。哈维氏弧菌(V.harveyi)[8]、细胞肿大病毒RBIV-C1[9]由实验室分离保存。反转录试剂盒、荧光实时定量试剂盒(SYBR EXScript qRT-PCR Kit)等购自TaKaRa生物有限公司； RNA提取试剂盒(EZNA Total RNA Kit)、凝胶回收试剂盒购自Omega公司，RNA反转录试剂盒购自Thermo公司，Leibovitz′s L15培养液购自吉诺生物医药技术有限公司，小鼠抗His抗体， FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自康为试剂公司。蛋白表达载体pET32a 购自Novagen公司。序列测序及引物合成由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1 CsCD80 基因序列获得及序列分析

从NCBI数据库中半滑舌鳎的全基因组中获得CsCD80的基因序列，信号肽序列预测采用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守结构域预测采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，多重序列比对使用DNAMAN，比对结果以序列相似度(sequence identity)形式表示。

1.2.2实时荧光定量PCR检测CsCD80在不同组织中的表达量

为检测正常生理状况下CsCD80在不同组织中的表达量，将健康半滑舌鳎随机分组，每组5条，麻醉后取心脏、血、肝、脾、头肾、鳃、肌肉、脑和肠组织，按照EZNA Total RNA Kit说明提取总RNA，用Nanodrop测定其纯度，通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。并根据反转录试剂盒使用说明反转录成 cDNA，以该cDNA 为模板，β-actin 基因为内参基因进行实时荧光定量 PCR。根据 β-actin 基因和CsCD80 基因序列分别设计引物为：β-actin-F(5′-GCACGGTATTGTGACCAACTGG-3′)、β-actin-R(5′-CAGGGGAGCCTCTGTGAGC-3′)、CsCD80-RT-F(5′-CCAGAAACCAAGATGAGGATGA-3′)、CsCD80-RT-R(5′-TGAAGACAGCGGTGGAGGA-3′)。反应体系为20 μL， 包括SYBR Premix ExTaq10 μL，CsCD80-RT-F(β-actin-F) 0.2 μL，CsCD80-RT-R(β-actin-R) 0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA模板2 μL。在Eppendorf Mastercycle实时定量 PCR 仪上进行， 反应程序为： 95℃预变性30 s；95℃退火5 s，59℃退火30 s， 72℃延伸10 s， 40个循环。采用 2-ΔΔCT法计算CsCD80表达量[10]， 并使用 Excel软件进行数据分析。

为检测在哈维氏弧菌(V.harveyi)刺激下CsCD80表达量的变化，使用LB培养基将V.harveyi培养至OD600=0.8，用PBS缓冲液洗3次并重悬至2×106CFU/mL，制成细菌悬液备用。将健康半滑舌鳎随机分成2组，每组20条，实验组每条注射50 μL细菌注射液，对照组每条注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。感染6、12、24和48 h后取样，每个处理每个时间点随机选取5条鱼，收集肝、脾和头肾组织。分别以18S rRNA、ribosomal protein L18(RPL18)和β-actin作为内参基因，按照上述方法检测细菌刺激后半滑舌鳎肝、脾、头肾组织中的CsCD80表达量变化。

图1 CsCD80相似序列比对Fig 1 Alignment of the sequences of CsCD80 homologues括号内为CsCD80与比较序列的相似度。保守氨基酸残基用黑色阴影标出，相似度>75%的氨基酸残基用红色阴影标出，相似度>50%的氨基酸残基用蓝色阴影标出。

为检测在细胞肿大病毒RBIV-C1刺激下CsCD80表达量的变化，用PBS缓冲液将RBIV-C1病毒组织液稀释到5×105拷贝/mL制成病毒注射液备用。将健康半滑舌鳎随机分成2组，每组20条，实验组每条注射50 μL病毒注射液。对照组每条腹腔注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。侵染后1、3、5和7 d时取样，每个处理组每个时间点随机选取5条鱼，收集肝、脾和头肾组织。以β-actin作为内参基因，按照上述方法检测病毒刺激后半滑舌鳎肝、脾和头肾组织中的CsCD80表达量变化。每组实验重复3次。

1.2.3重组CsCD80蛋白(rCsCD80)和重组Trx蛋白(rTrx)的表达和纯化

重组蛋白表达使用蛋白表达载体pET32a。首先构建重组表达质粒pETCsCD80，设计特异性引物CsCD80-F(5′-CCCGGGATGGGAGGTCTCCTGCA-3′ ，加下划线的序列为SmaI酶切位点)、CsCD80-R(5′-CCCGGGAGTATTTGGCCAGTCGGG-3′，加下划线的序列为SmaI酶切位点)扩增CsCD80的胞外段(34～241位氨基酸)，PCR产物克隆至T-A的克隆载体pEASY-T1后，提取质粒，重组质粒用SmaI内切酶消化后，切胶回收酶切目的片段，将回收的酶切目的片段插入表达质粒pET32a。经转化、挑选单克隆、菌落PCR和测序确认后，将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中，在LB培养基中37℃培养至OD600=0.5，加入0.4 mmol/L IPTG后，于16℃诱导培养12 h，收集菌液，经液氮速冻、超声破碎后，使用Ni-NTA琼脂糖柱纯化蛋白质，将纯化后的重组CsCD80蛋白(rCsCD80)装入透析袋中进行复性[11]。同时，使用pET32a表达重组标签蛋白rTrx，作为后续实验的对照蛋白。蛋白浓度使用Nanodrop测定。

1.2.4rCsCD80与半滑舌鳎外周血淋巴细胞(PBL)的相互作用

用Percoll密度梯度离心法[12]提取健康半滑舌鳎(750±10)g的外周血淋巴细胞，在L15培养液中稀释至1×108细胞/mL，将rCsCD80、rTrx加入PBL悬液中，使其终浓度为80 μmol/L，28℃孵育2 h后，PBS洗3次，加入稀释1000倍的小鼠抗His抗体，37℃孵育1 h后，PBS洗3次，加入稀释1000倍的FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃避光孵育1 h后，PBS洗3次，滴加至载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察、拍照。

2　结果

2.1　CsCD80序列分析

CsCD80基因序列开放阅读框含有882个碱基，共编码293个氨基酸，其理论分子质量为32.45 ku，理论等电点pI=7.97，N-末端1～31位氨基酸残基为信号肽序列，37～129位氨基酸残基为免疫球蛋白V区(IgV)结构域，是免疫球蛋白超家族的保守特征，233～267位氨基酸为α螺旋的跨膜(TM)结构域。氨基酸组成中丝氨酸(Ser)含量最高，占11.26%。选取与CsCD80序列相似度最高的前7个物种进行多重序列比对(这7个物种按相似度从高到低，其GenBank登录号依次为：XP_019950451.1、XP_019903483.1、XP_014070714.1、ACH58053.1、XP_017346141.1、XP_018918527.1、XP_017206576.1)。结果表明，CsCD80与牙鲆(Paralichthysolivaceus)CD80相似性最高，为41.37%，与其他鱼类的CD80相似性较低(19.01%～41.37%)，见图1。

2.2　CsCD80在半滑舌鳎不同组织中的表达

通过实时荧光定量PCR技术检测CsCD80在健康半滑舌鳎的不同组织中的表达情况。实验结果显示，CsCD80在检测的9种组织中均有表达，其中在肝中表达量最高，其次为脾、心、脑、鳃、肌肉、肾、肠和血，肝中的表达量为血中的表达量的508.2倍(图2)。

2.3 哈维氏弧菌、细胞肿大病毒感染后半滑舌鳎中CsCD80的表达

在V.harveyi感染半滑舌鳎6、12、24和48 h后，通过荧光定量PCR技术检测CsCD80在肝、脾、头肾中的表达情况。实验结果显示，肝中CsCD80在感染后6、12、24和48 h表达量均有显著上调，脾中CsCD80在感染后6 h表达量显著上调，头肾中CsCD80在感染后6、12和24 h表达量均有显著上调，在肝、脾、头肾中CsCD80的最大表达量分别出现在感染后的24、6和24 h，表达量为对照组的66.7倍、14.3倍和3.3倍(图3-A～C)。在病毒RBIV-C1感染半滑舌鳎的1、3、5和7 d后，通过荧光定量PCR技术检测CsCD80在肝、脾、头肾中的表达情况。实验结果显示，肝中CsCD80在感染后3、5和7 d表达量均有显著上调，脾中CsCD80在感染后1 d和3 d表达量均有显著上调，头肾中CsCD80在感染后1、3、5和7 d表达量均有显著上调，在肝、脾和头肾中CsCD80的最大表达量分别出现在感染后的3 d、3 d和7 d，表达量为对照组的9.6倍、12.3倍和6.2倍(图3-D～F)。

图2 CsCD80在健康的半滑舌鳎组织中的表达情况

为方便比较，将血中的相对表达量设为1；数据为3次实验数据的平均值，以平均值±标准误差表示

图3 细菌、病毒感染后CsCD80在半滑舌鳎组织中的表达情况

实验组半滑舌鳎感染哈维氏弧菌(A～C)和细胞肿大病毒(D～F)；对照组半滑舌鳎未感染细菌和病毒，用实时荧光定量PCR技术测定不同时间点CsCD80在肝、脾、肾中的相对表达量。对照组的相对表达量设为1，数据为3次实验数据的平均值，以平均值±标准误差表示。*P< 0.05；**P< 0.01

2.4　rCsCD80与半滑舌鳎外周血淋巴细胞(PBL)的结合

通过原核表达的方法获得rCsCD80和rTrx(图4)。rCsCD80和rTrx与半滑舌鳎的PBL孵育后，用带有绿色荧光的抗体检测与细胞结合的重组蛋白。结果表明，rCsCD80与PBL孵育后，在荧光显微镜下观察到PBL表面有绿色荧光，而rTrx与半滑舌鳎PBL孵育后，在PBL表面未观察到绿色荧光(图5)。该结果说明rCsCD80能够与PBL结合。

图4 rCsCD80和 rTrx的聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig 4 SDS-PAGE analysis of rCsCD80 and rTrx

泳道1：蛋白Marker；泳道2：重组表达的CsCD80蛋白；泳道3：重组Trx蛋白

图5 rCsCD80与半滑舌鳎外周血淋巴细胞(PBL)的结合Fig 5 Binding of rCsCD80 to the peripheral blood lymphocytes(PBL) of C. semilaevis

半滑舌鳎PBL先与rCsCD80(A-C)或rTrx(D-F)孵育后，再与抗His-tag抗体孵育，随后与FITC标记的二抗孵育，在荧光显微镜下观察。C为A、B融合后的图；F为D、E融合后的图

3　讨论

本研究从半滑舌鳎全基因组数据库中克隆得到了CsCD80序列。序列分析表明，CsCD80与牙鲆CD80同源性最高。氨基酸序列分析表明，CsCD80包含两个保守结构域，即免疫球蛋白V区结构域和α螺旋结构跨膜结构域，而在虹鳟鱼中，CD80不仅包含这两个保守结构域，还包含一个免疫球蛋白C区(IgC)结构域[3]。这些结果说明在不同鱼类中CD80存在序列和结构上的差异。

组织特异性表达分析表明，在健康状态的半滑舌鳎中，CsCD80在9种组织中有不同程度的表达，其中在肝和脾中的表达量较高，该结果与已报道的尼罗罗非鱼组织表达情况较相似[5]，而在虹鳟鱼中，CD80在血中表达量最高，脾中表达量次之[3]。这可能是由于虹鳟和半滑舌鳎免疫机制存在差别有关。在人类CD80研究中， CD80分子存在于肝细胞表面，且在丙型肝炎病毒刺激下，CD80在肝细胞中表达量上调，说明在人体中CD80可能发挥保护肝细胞的作用[13]。此外，肝是补体合成的主要器官，因此推测半滑舌鳎中CsCD80在肝中表达量最高可能是一种自身保护机制，保护细胞免受由补体引起的损伤。脾脏是鱼类重要的免疫器官，是鱼类机体中中性粒细胞、 红细胞等产生、 储存和成熟的主要场所，具有产生各种免疫细胞的功能，在鱼类特异性免疫过程中发挥重要作用[14-15]。在本研究中，CsCD80在半滑舌鳎脾脏中有大量表达，可能说明CsCD80在脾脏中参与半滑舌鳎的免疫进程。

在虹鳟CD80研究中发现，用大肠杆菌脂多糖和弧菌毒素对虹鳟进行免疫刺激后，CD80表达量显著上调[3]。在尼罗罗非鱼中，用灭活无乳链球菌对其进行免疫刺激后，CD80在罗非鱼的肠、鳃、脑、脾、肾、胸腺中表达量均显著上调[5]。在本研究中也存在类似现象，V.harveyi和细胞肿大病毒是半滑舌鳎养殖业中的常见病原微生物[6-7]，在V.harveyi和细胞肿大病毒感染半滑舌鳎后，CsCD80在肝、脾、头肾中的表达量均呈现显著上调，且呈现出时间依赖性表达模式。这些结果表明CsCD80可能在半滑舌鳎抵抗V.harveyi和细胞肿大病毒侵染的免疫应答过程中发挥重要作用。

在人类CD80研究中发现，CD80能刺激PBL使其增殖，从而增强机体的免疫反应[16]。在本研究中，rCsCD80与半滑舌鳎PBL孵育后，通过免疫荧光检测，可观察到半滑舌鳎PBL表面出现绿色荧光，说明rCsCD80能结合到PBL表面，由此推测半滑舌鳎PBL表面可能存在rCsCD80的配体，rCsCD80通过与PBL表面配体结合，可能会进一步刺激PBL增殖从而加强机体的免疫反应强度。

4　结论

本研究克隆了半滑舌鳎CsCD80的DNA序列，通过序列比对发现其与牙鲆CD80序列相似度最高。在健康状态的半滑舌鳎中，CsCD80在肝和脾中具有高表达量，在细菌和病毒感染后，CsCD80 在肝、脾、头肾中表达量均有显著上调，且呈现时间依赖模式，揭示CsCD80可能在半滑舌鳎的抗感染免疫应答过程中起重要作用。进一步研究发现rCsCD80能够结合到PBL表面，暗示rCsCD80可能通过与PBL上的配体结合而引发细胞免疫应答反应。本研究结果为深入研究半滑舌鳎CD80的免疫机制奠定了基础。

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