刘秀丽 ，毕力格吐 ，李树森 ，韩文芳 ，李 锋 ，裴 乐 ，侯勇跃 ，李元恒 ，刘 威

（1.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所，呼和浩特010031；2.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；3.正蓝旗牧草种籽繁殖场，正蓝旗 027200；4.巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心，巴彦淖尔015000；5.中国农业科学院草原研究所，呼和浩特010010）

红豆草（Onobrychis viciifolia,Sainfoin）是国内外广泛栽培的优良豆科类牧草，也叫驴食豆、驴喜豆，原产欧洲，素有“牧草皇后”、“圣草”之称，对草原畜牧业可持续发展具有一定的竞争力地位[1]，被认为是解决紫花苜蓿引起牲畜臌胀病的一种理想牧草[2-3]。红豆草在内蒙古、宁夏、陕西等省区种植较多，新疆天山北阴坡处有野生分布。耐旱性强，是非灌溉条件下不可代替的牧草，且产量高、营养价值高、适口性好，而且富含单宁，所以在发展畜牧业和改善环境等方面发挥着日益重要的作用。目前，生产和应用的主要品种有5个[4]；蒙农红豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Mengnong,内蒙古农业大学育成,1995年经全国草品种审定委员会审定登记，优质、高产、抗逆性强）；甘肃红豆草 (Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Gansu,甘肃农业大学育成）；顿河红豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Taneitica spreng，分布在新疆天山、阿尔泰地区，一个抗寒力强、蛋白含量高、适口性好的优良野生品种）；麦罗斯红豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Melrose,加拿大育成品种）和埃斯基红豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Eski,美国蒙大拿农业试验中心)。其中，蒙农红豆草已在内蒙古中、西部干旱、半干旱地区及宁夏等地大面积种植。红豆草在生长的各个阶段都富含单宁，且动物喜食。研究表明，反刍动物采食含单宁饲料后，可以减少瘤胃可降解蛋白质的数量，提高蛋白质的利用效率，也能有效提高动物的生产性能；如羊毛产量、泌乳量、肉品品质等；且单宁具有抗菌、抗寄生虫、抑制反刍动物瘤胃膨胀等的作用，临床可以在生长期采集与苜蓿混合饲喂防止反刍动物膨胀病发生，或者将粗提单宁制成饲料添加剂指导临床饲喂，防止寄生虫病及减少致病菌的排出，减少临床抗生素药物的使用，提高畜产品质量，为健康绿色养殖奠定基础，所以值得大力开发和利用。关于我区的蒙农红豆草研究主要集中于种子特性、出苗率等方面，未有对红豆草单宁含量测定的报道。本试验的主要目的是测定我区蒙农红豆草缩合单宁含量，以期为将来进一步开发利用红豆草及单宁提供数据支持和理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

蒙农红豆草：采用自种试验田的生长期（4～5月）、开花期（5～6 月）、成熟期（7～8 月）的全植株、茎和叶子，50℃烘干并磨碎过1mm筛孔，备用。

红豆草单宁纯品：由内蒙古农牧业科学院实验室提取，纯度≥98%。

1.2　主要试剂

丙酮(北京化工厂，20140918)；正丁醇(天津市风船化学试剂科技有限公司，20140312)；乙醚(USA，095179)。

1.3　主要的仪器设备

旋转蒸发仪(RE-52CS-1),真空冷冻干燥机（SJIA-N），紫外-可见分光光度计（UV1000），24 针氮气吹干仪（Organomation），交联葡聚糖柱（Sephadex LH-20）。

1.4　实验方法

1.4.1可提取缩合单宁(extractable condensed tannin,ECT)的含量测定

1.4.1.1标准曲线的配制

取红豆草单宁纯品作为标准物质做标准曲线，利用储备液（浓度为1.0mg/mL）配制5个标准工作液，浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0mg/mL。分别配制2mL各浓度标准液到5mL的离心管中，摇匀，备用。

1.4.1.2可提取缩合单宁的含量测定

（1）单宁提取液的制备称取200±0.1g备用样品置于50mL离心管中，加入8mL提取试剂（70%丙酮），旋涡混匀后室温放置20min，每5min涡1次，3500g离心10min，将上清液转移到另一50mL试管中。重复提取2～3次后，合并上清液，沉淀放4℃保存，以用来测定蛋白结合单宁 (protein-bound condensed tannin,PCT)含量。在上清液中加入24mL乙醚，混匀后，室温放置2min，如果没出现分层，继续加乙醚，直到分层，弃去上层溶液，保留下层。利用氮气吹干仪40℃吹3h，取出后加去离子水到50mL,混匀。如果有杂质，取4mL水溶液，15000g离心5min即可。放置4℃待测。

（2）可提取缩合单宁含量测定取出1mL标准工作液（1.4.1.1）及待测样品到15mL螺口试管中，加入6mL测定试剂（l-正丁醇∶36%盐酸 95∶5），充分混匀，沸水浴中放置 75min，拿出后冰浴。在550nm的紫外分光光度计下读数。

1.4.2蛋白结合单宁含量的测定

1.4.2.1单宁提取液的制备 在可溶性缩合单宁提取后的沉淀中，加入4mL提取试剂A（用 10mMtris/chloride溶液制成10%（W/V），再加入 20%的 2-巯基乙醇），混匀，室温放置 20min，再混匀，放入沸水中45min，再放入冷水中冷却到室温 （19℃～24℃），3500g离心10min，将上清液转移到15mL螺口试管中，再重复提取2次，合并上清液。用提取试剂A再冲洗沉淀2～3次，使体积达到15mL，混匀，作为待测样品。将沉淀放4℃保存，以用来测纤维结合单宁（FCT,fiber-bound condensed tannin,FCT）。

1.4.2.2蛋白结合单宁含量测定 取待测样品2mL，15000g离心5min，作为待测样品。标准曲线以及测定方法同1.4.1.2(2)。

1.4.3纤维结合单宁含量的测定

1.4.3.1单宁提取液的制备 提取蛋白结合单宁后的残渣，再加入 10mL 的测定试剂（1-正丁醇-36%盐酸，V∶V，95∶5）和 1mL的提取试剂A，混匀后，室温放置10min，混匀。取1.5mL离心，15000g离5min，上清液待测。

1.4.3.2纤维结合单宁含量测定 取待测样品2mL，15000g离心5min，作为待测样品。标准曲线以及测定方法同1.4.1.2(2)。

1.5　总缩合单宁含量测定

总缩合单宁含量为可提取缩合单宁、蛋白结合单宁和纤维结合单宁的和。

1.6　数据处理

数据的平均值、标准偏差和标准误差均采用EXCEL函数计算。所有数据均经过Mixed程序进行方差分析（SAS9.0），采用单因素ANOVA分析。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。

2　实验结果

2.1　可溶性缩合单宁含量的测定

如图1、图2所示，蒙农红豆草全植株可提取缩合单宁含量分别为：生长期131.44g.Kg-1DM(Drymatter,DM)，开花期 78.06g.Kg-1DM，成熟期41.61g.Kg-1DM；蒙农红豆草不论是全植株、茎、叶子中可提取缩合单宁的含量均为生长期最高（P＜0.05）；蒙农红豆草在各个生长阶段中均是叶子中含有的可提取缩合单宁比茎中的含量高(P＜0.01)，生长期叶子中可达156.93g.Kg-1DM，随着植株的生长成熟，可提取缩合单宁的含量在逐渐下降，成熟期时茎中含量几乎降为零。

2.2　总缩合单宁含量的测定

如表1所示，蒙农红豆草所含单宁以可提取缩合单宁为主，约占到总缩合单宁含量的83.4%～92.5%，基本同Terrill所述[5]。所以，通常所说的红豆草单宁就是指可提取缩合单宁。在不同生长阶段生长期的全植株总缩合单宁显著高于开花期和成熟期（P＜0.05），不同生长时期总缩合单宁含量均为叶子比茎高 （P＜0.01）。

3　讨论

3.1　植物单宁的提取方法

图1蒙农红豆草在不同生长期全植株可提取缩合单宁的含量(g.Kg-1 DM)

图2蒙农红豆草在不同生长期茎和叶子中可提取缩合单宁的含量(g.Kg-1 DM)

表1　蒙农红豆草不同生长时期的茎、叶和全植株中总缩合单宁的含量（g.Kg-1 DM）

关于植物单宁提取方法很多，但一般从植株中分离缩合单宁采用极性溶剂。据资料显示，有研究者用50%甲醇溶液提取高粱单宁；用70%甲醇溶液（其中含0.5%甲酸和0.05%抗坏血酸）提取豆科植物单宁；用75%丙酮溶液提取红豆草单宁；用合成酒（80%乙醇溶液中含有0.7g/L的酒石酸和1.11g/L的酒石酸氢钾）从葡萄籽中提取花青素。本实验采用了目前实验室常用的提取方法：70%丙酮溶液（0.1%抗坏血酸）。

3.2　含量测定

测定缩合单宁常用的方法是盐酸/丁醇法，是因为原花色素在热酸条件下能够水解产生性质稳定的红色物质花色素，可以在暗处保存几天不变色。其中，在测定单宁过程中，标准品选择是非常重要的，选择合适的标准品才能够实现较准确的定量分析。即便是同种牧草，在不同时期不同地点收获的样品，单宁的含量差异性也会较大。所以，最好是能够利用待测样品自身提取并纯化后的单宁来作为标准品。

3.3　影响缩合单宁合成的因素

实验表明，蒙农红豆草缩合单宁含量随着植株的成熟度增加而降低。这主要是因为红豆草所含缩合单宁大部分都存在于叶子中，随着植株的不断成熟，缩合单宁在叶子中浓度下降有关系。红豆草的分子量范围为6000～28000Da，单宁仅是多酚的一部分；植物组织合成单宁的量会受很多因素影响，包括植物品种、植株不同部位、成熟度、土壤肥力、生长季节和温度及水分等，且同一植物在不同组织中单宁的合成可能是有不同的控制途径，这还需要进一步研究确证。

4　结论

蒙农红豆草所含缩合单宁占总缩合单宁含量的83.4%～92.5%；生长期所含缩合单宁含量最高；且主要分布在叶子上，可达156.93g.Kg-1DM。

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[2]M cmahon LR,M callister T A,Berg B,et al.A review of the effects of forage condensed tannins on ruminal fermentation and bloat in grazing cattle[J].Canadian Journal of Plant Science,2000,80:469-485.

[3]W ang Y P,Yang Z M,Zhang B.Identification of protein related to biosynthesis of condensed Tannin in Onobrychis tanaitica spreng[J].Acta Agrestia Sinica,2000,8(2):126-131.

[4]冷小云.红豆草品种对黑斑病和轮纹病的抗性评价[D].硕士学位论文.兰州:兰州大学,2009.

[5]Terril T H,Rowan A M,Douglas G B,et al.Determ ination of extractable and bound condensed tannin concentrations in forageplants,protein concentrate meals and cereal grains[J].Journal of the science of food and agriculture,1992b,58:321-329.