齐衍超 陈燕 超海鹏 巩峰贤

潍坊市食品药品检验检测中心 山东潍坊 261105

近年来，毛细管电泳在和各种检测技术的融合运用的过程中体现出良好的分析能力，可分析范围较广。但毛细管电泳也存在一些缺点，如它的进样量很小，需要检测仪器具备很高的灵敏度，响应速度以及空间分辨能力。因此，人们对检测器进行了持续研究，近年来，电化学（ECL）技术凭借其简单、可以实现微型环境的高灵敏检测的特点，被应用于毛细管电泳分离检测。1987年，Danielson等人提出Ru(bpy)32+和烷基胺的电化学技术，说明了电化学强度与胺结构的关系[1]。从此Ru(bpy)32+ECL体系逐渐在应含氮化合物分析中得到广泛应用。而毛细管电泳Ru(bpy)32+电化学发光联用技术（CE-ECL）兼具高效电泳分离、灵敏电化学发光检测的功能，在药物、环境污染等方面的检测中应用越来越广泛。

1 毛细管电泳电化学发光CE-ECL在药物检测中的应用

1.1 药物部分

盐酸硫利哒嗪，又成为盐酸甲硫达嗪，其化学式为C21H26N2S2·HCl，颜色呈白色或类白色，形态为结晶性粉末，有轻微的臭味，能溶解于乙醇，是一种抗精神病药。利用CE-ECL分析检测盐酸硫利哒嗪可以获得更高的灵敏度，而且操作简便，损耗较小。

1.2 试验部分

盐酸硫利哒嗪购自中国药品生物制品检定所。试验所需的氯化三联吡啶耔六水和物购自于J&K化学药品公司。用Na2HP04、KH2P04配制成pH值不同的一组68mmol/L的磷酸缓冲溶液。试验所需的水均为蒸馏水，化学试剂的纯度基本均在分析纯以上，全部试验所需溶液在使用前都经由水膜过滤处理。

1.3 试验仪器

电化学分析仪：EC6100型（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）

工作电极：直径一毫米铂电极

参比电极：Ag/AgCl电极。

毛细管电泳电化学发光检测仪：RM02-MPI-A型（北京中西远大科技有限公司），该检测仪主要包括四个部分：数控采集分析仪、化学发光检测器、高压电源、恒电位仪。

电化学发光检测池：该检测池处于发光检测器中，主要由三电极系统构成，分别为工作电极：直径300µm的铂电极；参比电极：Ag/AgCl电极；铂电极作为对电极。可以将Ru(bpy)32+溶液加入磷酸缓冲液中，但Ru(bpy)32+将吸附于毛细管上，降低毛细管电泳的分析效率。因此，一般情况下都是将Ru(bpy)32+溶液加入到电化学发光检测池中，在施加制定电位，Ru(bpy)32+将在工作电极表明被氧化成Ru(bpy)32+毛细管末端和工作电极表面的距离应设为100µm。待分析的药物样品从毛细管中转移出来后与Ru(bpy)32+在工作电极表面发生氧化还原反应，生成激发态Ru(bpy)32+，它在恢复到基态的过程中会释放光子[2]。利用光电倍增管收集光信号。考虑到溶剂会蒸发以及毛细管内部流出溶液的稀释作用，需要每隔两个小时更换一次Ru(bpy)32+，以免影响Ru(bpy)32+溶液浓度，大致分析过程受到干扰或产生损耗效应。

未涂层熔融石英毛细管：(50μm×50cm，有效长度41cm)，第一次使用前需要使用将其置于0．1mol/L的NaOH溶液中浸泡二十四小时，取50cm长的未涂层熔融石英毛细管置于两溶液池之间充当分离通道，在进样端施加高压，每次运行前用NaOH冲洗十分钟，再用缓冲溶液冲洗至CL基线平稳。

1.4 配制标准溶液

在10ml的乙醇中溶解40.7mg的盐酸硫利哒嗪制取0．01mol/L的盐酸硫利哒嗪母液，将其放置于冰箱中，温度控制在4℃。每次开始试验前，可以用乙醇稀释盐酸硫利哒嗪母液，以制得浓度不同的标准溶液。

1.5 结果和讨论

在Ru(bpy)32+溶液中盐酸硫利哒嗪的循环伏安如下图所示：

图1 盐酸硫利哒嗪的循环伏安

如上图所示，曲线a表示磷酸缓冲溶液中铂电极的循环伏安图，由图可知其没有氧化还原峰，但是铂电极Ru(bpy)32+溶液中的循环伏安图存在非常明显的氧化还原峰，这个氧化还原峰是Ru(bpy)32+所独有的。当我们将100Lµ，摩尔浓度为O.01mol/L利用乙醇稀释制成的盐酸硫利哒嗪标准溶液加入800Lµ、摩尔浓度为5mmol/LRu(bpy)32+溶液后，将得到如图1中的曲线c所示与之前明显不同的循环伏安图。此时氧化峰的电流增大，而还原峰的电流减小。这是因为Ru(bpy)32+在工作电极的表面发生氧化反应失去一个电子生成Ru(bpy)32+，Ru(bpy)32+从盐酸硫利哒嗪溶液中得到一个电子恢复成二价态，但是却呈现出激发态，当处于激发态的Ru(bpy)32+回复到基态的过程中将释放光子。可见，从某种意义上来说，Ru(bpy)32+浓度明显增加，自然就会出现氧化峰电流增大、还原峰电流减小的现象，我们可以利用这一现象来检测盐酸硫利哒嗪。

1.6 分析条件的优化

根据上述分析可知，当盐酸硫利哒嗪溶液经由毛细管电泳至电化学发光检测池中后，光电倍增管将会收集到光信号，根据此原理检测盐酸硫利哒嗪。为了增强试验效果，需要针对影响盐酸硫利哒嗪电化学发光信号强度以及分离效果的各种因素进行优化，如应用电压、迸样电压、持续进样时间、磷酸缓冲溶液pH值等。

应用电压对电化学发光强度的影响。发光试剂氧化速率会影响电化学发光强度，而，工作电极上的应用电压会影响光试剂氧化速率。应用电压过低，Ru(bpy)32+难以被氧化，应用电压上升时，电化学发光强度也会提升，当超过1.2v时电化学发光强度又会降低。因此，1.2V就是最佳的应用电压。

进样电压大小、进样持续时间长短对电化学发光强度有较大影响，因为分析物的量由进样电压、进样持续时间决定，分析物的量又决定了电化学发光强度。当进样持续10s，进样电压为10kV，电化学强度将显著增强。

（3）电化学发光反应和pH有直接关系，因此，磷酸缓冲溶液pH值会影响电化学发光强度。在本次试验中pH值从6.5上升至8.0时，电化学发光强度提升，当pH值超过8．0，时，电化学发光强度减小。

2 结语

综上所述，本文采用毛细管电泳电化学发光CE-ECL方法构建了操作简便、结果可靠、复现性好的方法用于检测盐酸硫利哒嗪，并针对相关的试验仪器、试验条件进行了分析优化。试验证明该方法可以用于药物检测，生物活性的分析。