罗宇文，李瑶

复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所，上海　200433

游离循环DNA (Circulating cell free DNA，cfDNA) 是一种细胞外游离状态的DNA，长度一般在180 bp左右，肿瘤病人体内的cfDNA部分来源于肿瘤细胞，被称为循环肿瘤DNA (Circulating cell free tumor DNA，ctDNA)[1]。理论上，通过检测肿瘤病人 cfDNA中肿瘤相关基因突变应与肿瘤组织中含有的基因突变一致，进而可实现肿瘤基因的微创检测，即液体活检，本方法可克服传统检测方法对组织样本的依赖性等难题[2]。目前，基因突变常用的检测方法主要有：直接测序法、实时荧光定量法、高分辨率熔解曲线、质谱及高效液相色谱法等[3]。然而，鉴于外周血中cfDNA的丰度较低，其有大量野生型基因背景，故采用传统方法进行检测的难度较大。如实时荧光定量PCR仅能在野生型背景中检出30 pg左右的突变；测序法虽然准确度更高，但最低只能测得 1%左右，而且成本较高。

微滴式数字 PCR (Droplet digital pCR，ddPCR) 是一种同时具备高灵敏度和高准确性的PCR检测方法，对于突变检测的理论检测下限可有效达到0.001%[4]。其利用油包水原理将PCR反应体系分散为数万个微滴，每个微滴都是一个单模板PCR反应室。模板DNA在微滴中扩增后释放荧光信号。通过对每个微滴荧光信号的逐一收集来统计PCR扩增阴性和阳性微滴的数量，并通过泊松分布换算成核酸的初始拷贝浓度，进而对模板初始浓度进行精确到单拷贝的定量[5]。微滴内的模板拷贝数为个位数而微滴本身的体积极小，所以相对而言，反应体系中低丰度突变基因的相对丰度很高，因此每个微滴独立检测时的灵敏度会获得大幅提升[6]。……