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流产衣原体(Chlamydophila.abortus)是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，主要造成山羊、绵羊等小型反刍动物的流产性疾病[1-2]。C.abortus还可以感染牛、猪及造成怀孕妇女的流产，是一种非常重要的人兽共患传染病[3]。

我国对于流产衣原体的预防主要采用中国农业科学院兰州兽医研究所研发的流产衣原体卵黄囊甲醛灭活油佐剂疫苗，此疫苗多年前在青海、甘肃、新疆等省份推广使用[4]。可以为动物提供很好的免疫保护效果，达到预防流产的目的。然而，在疫苗制备过程中，小鼠作为理想的模式动物已经被用于流产衣原体灭活疫苗的效价检测[5]。效检方法主要是对免疫组小鼠和对照组小鼠的脏器进行姬姆萨染色涂片，通过普通光学显微镜检查衣原体原生小体(EB)为主[5]，其结果判定往往受主观因素的影响，无法从科学的角度来说明衣原体灭活疫苗的质量保证[6]。因此，本研究拟建立针对C.abortus的富含半胱氨酸的胞质蛋白(envB)基因实时定量PCR方法，以期通过检测小鼠脏器C.abortus菌体载量，为流产衣原体灭活疫苗的效检提供科学可靠的方法。

1　材料与方法

1.1菌株及DNA流产衣原体、布鲁氏菌DNA、均来自本实验室，弓形虫DNA由周东辉博士提供。

1.2主要试剂及仪器pMD19-T simple vector、2×Premix ExTaqTM 、DL 2000 DNA Marker、Trans2KPlus II DNA Marker、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA extraction kit、MiniBEST Plasmid purification kit、SYBR Premix EX TaqTMⅡ及感受态细胞DH5α均购自 TaKaRa 公司。

1.3引物的设计与合成envB基因引物设计参考GenBank的C.abortusenvB基因序列(登录号NC_004552.2)，利用Premier 5.0 软件设计envB基因引物CloneF/CloneR和envB基因real-time PCR引物(表1)。两对引物均由上海生工有限责任公司合成。

表1引物的序列
Tab.1Nucleotide sequences of primers and probe

名称Names序列(5′⁃3′)Sequences长度/bpLengthClone⁃FGTTCATTTGCCAGCGGGAAGATAGAGG27Clone⁃RAGAACCACGGTTTGTTACACAAATACGG28Env⁃FAACCTCAGATAGCAAATTAATCTGG25Env⁃RATTTGGTATAAGAGCGAAGTTCTGGGGGG25

1.4重组质粒标准品的构建按照MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit说明书提取流产衣原体(SX5)标准株的核酸作为模板，进行PCR扩增目的基因。……