夏 　莹，付少华，张寅静，王 　薇

（湖北省疾病预防控制中心，湖北省预防科学院，湖北 　武 汉 　430065）

农业产业化的发展使农产品的生产越来越依赖于农药等外源物质。我国农药的用量居高不下，随着过去使用的许多农药被检测出具有致突变、致畸和致癌性，新上市的农药品种也越来越多，对这些品种农药的快速评价成为目前亟待解决的问题。目前已建立的短期遗传毒理学试验较多，这些试验方法耗时短、价廉、灵敏度高，在农药、化学品暴露的生物学效应评价中取得了较好的评价效果。农药哌虫啶是一种新烟碱类杀虫剂，具有高效、广谱等特点，本研究采用哌虫啶进行体外CHO-K1细胞HGPRT基因突变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，旨在短期内分析农药哌虫啶是否具有遗传毒性。

1　材料与方法

1.1　HGPRT基因突变试验[1]

1.1.1试剂及仪器 细胞株及来源：中国地鼠卵巢(CHO-K1)细胞株，购于中国典型培养物保藏中心，采用DMEM/F12培养基(含10 %胎牛血清及1%双抗)，37.0℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。代谢活化系统：代谢活化剂为哺乳动物肝微粒体酶活化系统(S9)，购自美国Moltox公司，批号4027。每毫升S9 mix的成分为S9 1.25 mL，MgCl2(0.4 mol/L) 0.2 mL，KCl(1.65 mol/L) 0.2 mL，葡萄糖-6-磷酸17.91 mg，辅酶Ⅱ(氧化型，NADP)30.615 mg，用无血清DMEM/F12 培养液补足至10 mL。主要仪器：SANYO MCO-18AIC 二氧化碳培养箱，SW-CJ-2F超净工作台。主要试剂：95%哌虫啶原药，江苏克胜公司提供；3-甲基胆蒽(methylcholanthrene，MCA，2.0 μL/mL)，美国Sigma 公司生产，批号LB83414V；甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，0.25 μL/mL)美国Sigma公司生产，批号BCBC4573V；以上试剂均用0.5%二甲基亚砜(DMSO，国药集团生产)溶解，批号20121130；6-巯基鸟嘌呤(6-mercaptopurine，6-TG)，美国Sigma公司生产。

1.1.2剂量设计与分组 根据预实验结果以625.0 μg/mL作为最高剂量(无细胞毒性，有可见沉淀)，以下剂量依次为312.5、156.3、78.1 μg/mL，同时作阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予无菌DMSO(+S9/-S9)；阳性对照组给予3-甲基胆蒽(+S9)、甲基磺酸乙酯(-S9)。

1.1.3突变试验 将经6-硫代鸟嘌呤筛选，选择生长良好的CHO-K1细胞用0.25%胰酶消化处理，用含10%胎牛血清的培养基制成细胞悬液(1.5×106/mL)，每个培养瓶(25 cm2)接种细胞悬液1.0 mL，另加含10%胎牛血清的培养基4 mL(3.0×105/mL)，置37 ℃、CO体积

2分数为5%的培养箱中培养48 h后，弃其培养液，加入4.5 mL含有阴性、阳性物或不同浓度受试物的培养液(不含血清)，+S9每培养瓶加S9混合液0.5 mL，-S9加入0.5 mL培养液。混匀后，置CO2培养箱培养4 h，弃上清，用D-Hanks液洗涤3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培养液，培养20 h。培养7 d后进行突变体的选择及集落形成率的测定，同时，每个培养皿接种200个细胞，每个剂量组设5个培养皿，7 d后，甲醇固定，Giemsa染色，观察细胞集落数，计算细胞存活率。培养7 d后，以2×105/皿接种，细胞贴壁后加入6-TG(终浓度为5 μg/mL)，每剂量设5个培养皿。同时另按200/皿接种，每剂量组设5个培养皿。与上述平皿同时放入培养箱7 d，固定、染色，计数集落并计算集落数、存活率(CFE)和突变频率(mutation frequency，MF)。计算公式为：

绝对CFE=形成集落数/接种细胞数；

相对CFE=试验组绝对CFE/溶剂对照组绝对CFE×100%；

突变频率=突变型细胞克隆数/(接种细胞数×克隆形成率)×100%

实验数据用Microsoft Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法。

1.2　小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验[1]

1.2.1试验动物 SPF级昆明小鼠购自湖北省实验动物研究中心，雌雄各25只。体质量25～30 g。SPF级屏障系统内进行。实验动物饲养于塑料饲育盒内，每笼5只，笼具、食盒每周更换一次并进行清洗消毒。环境条件：温度(23±3)℃，湿度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，噪音在60 dB以下；换气次数每小时10～18次。

1.2.2主要仪器和试剂 主要仪器有Olympus CX21显微镜。主要试剂有甲醇(国药集团生产)、吉姆萨染液(美国Sigma公司生产)

1.2.3剂量设计和分组 根据资料该受试物对雌、雄性大鼠的LD50均 大于5 000 mg/kg。按LD50的1/8、1/4、1/2设置低、中、高3个剂量组，分别为625、1 250、2 500 mg/kg，另设阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予纯水，阳性对照组按40 mg/kg给予环磷酰胺(CP)。动物按体质量随机分为5组，每组小鼠雌性5只，雄性5只。

1.2.4试验方法 分两次灌胃给予受试物，间隔24 h，受试样品各组每次小鼠灌胃容量均为20 mL/kg。于末次给予受试物后22 h处死动物，取股骨做骨髓涂片，自然干燥后用甲醇固定，Giemsa染色。每只动物油镜下观察1 000个嗜多染红细胞，记录出现微核的嗜多染红细胞数，其微核发生率以含微核的PCE千分率计；计数200个嗜多染红细胞数(PCE)，同时计数成熟红细胞数(NCE)，并计算PCE占红细胞总数(PCE+NCE)的百分比。

1.3　统计学方法

实验数据用Microsoft Excel软件建立数据库，计量资料采用t检验，计数资料采用非参数统计法。

2　结果

2.1　HGPRT基因突变试验结果

如表1所示，细胞毒性测试表明各组细胞相对存活率均大于50%。如图1所示，与阴性对照组比较，在活化系统和非活化系统条件下，受试样品各剂量组细胞基因突变频率差异均无统计学意义(P＞0.05)，阳性对照组细胞基因突变频率差异有统计学意义(p＜0.01)。

表1　细胞毒性测试和集落形成率(n=200)

图1　各受试物对基因位点突变频率的影响

2.2　小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果数据见表2。结果表明，受试物各组未成熟红细胞占红细胞总数的比例[PCE/(PCE+NCE)总数]均不少于阴性对照组的20%；与阴性对照组比较，阳性对照组雌雄小鼠微核率明显增加(p＜0.01)，而受试样品各剂量组雌雄小鼠微核率差异均无统计学意义(P＞0.05)，表明该受试样品骨髓细胞微核试验结果为阴性。

3　讨论

农药哌虫啶HGPRT基因突变试验与小鼠微核试验结果均为阴性，在本实验条件下未发现致突变性。化学有害物质导致的DNA损伤后主要表现为体细胞基因突变，此突变可导致发生多种疾病，并和肿瘤的发生关系密切，在化学物质导致基因突变作用中占有特殊地位[2]。在检测体细胞基因突变体系中，HGPRT基因突变是一种常用的方法，在有关化学物质遗传毒性检测策略的文献中也提到，为有效鉴定物质是否具有致突变性，一组小型试验中应当含有哺乳动物细胞突变试验[3]。因此，在评价农药哌虫啶遗传毒性的体外试验中，能够对体细胞的基因突变进行准确检测分析的方法常作为必选方法。有研究显示，应用中国仓鼠卵巢细胞CHO/ HGPRT基因突变试验方法，43种已知的具有致癌性化学物质中的40种化学物质在该试验结果中为阳性[4]。并且哌虫啶HGPRT基因突变试验结果还可为后续致癌性评价试验提供剂量参考。有几项研究中提到，微核试验在敏感性、准确性和特异性方面与染色体畸变试验方法几乎相当[5-6]。由于微核试验方法具有简便、快速、试验结果可信度高[7]、可在较短时间内检出染色体损伤效应、背景清楚、影响因素少、易重复等特点，故可被应用于哌虫啶的遗传毒理学中的染色体损伤的检测之前。此外，体内微核试验往往采用适合浓度的化合物处理，符合体内的正常生理状态，故在哌虫啶的安全性评价上更具生理学意义。

表2　哌虫啶原药试验结果(n=5)

[1] 中华人民共和国农业部. GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法[S]. 北京：中国标准出版社，1995：8.

[2] JAMES T M，DANIEL C，LUTZ M. Strategies and testing methods for identifying mutagenic risks[J]. Mutat Res，2000，455(1)：3-20.

[3] THYBAUD V，AARDEMA M，CLEMENTS J，et al. Strategy for genotoxicity testing：hazard identification and risk assessment in relation to in vitro testing[J]. Mutat Res，2007，627(1)：40-58.

[4] KARGALIOGLU Y，MCMILLAN B J，MINEAR R A，et al.Analysis of the cytotoxicity and mutagenicity of dringking water disinfection by-products in Salmonella typhimurium[J]. Teratog Carcinog Mutagen，2002，22：112-128.

[5] GALLOWAY S M，MILLER J E，ARMSTRONG M J，et al.DNA synthesis inhibition as an indirect mechanism of chromosome aberrations：comparison of DNA-reactive and non-DNA-reactive clastogens[J]. Mutat Res，1998，400(1)：168-186 .

[6] AMES B N， MCCANN J， YAMASAKI E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test[J]. Mutat Res，1975，31(6)：346-364.

[7] 王心如. 毒理学实验方法与技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2003.