王　军　赵　醒　赵宇阳　赵　杨　刘成一　申兴斌　李春辉

(承德医学院附属医院病理科，河北　承德　067000)

细胞分裂周期蛋白(CDC)25B属于苏/酪氨酸功能酶，主要发挥维持细胞正常生理功能的作用，可能与胚胎发育有关，该基因位于人类染色体20p13〔1〕，属于CDC25家族成员，CDC25B与人类的多种恶性肿瘤相关，其重要作用是促进细胞有丝分裂。在不同肿瘤组织中的检测证实，在肿瘤的生长和细胞的恶性转化过程中，CDC25B基因活性增强，过量表达，在消化道肿瘤中也有类似研究。CDC25B已成为医学研究的热点，对其基因和蛋白的检测可能成为肿瘤早期的生物学指标。CDC25B的具体作用机制与细胞周期密切相关，可去除CDK1中酪氨酸的残基，使G2～M 期转换，加速细胞分裂，因此本实验应用Western印迹及RT-PCR方法，在蛋白及分子水平联合检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1,CDC25B在胃癌组织中的表达。

1　材料和方法

1.1标本来源承德医学院附属医院病理科2008～2014年手术切除标本，所有患者为首次接受手术治疗，术前未行任何放疗及化疗，术后病理证实均为胃腺癌。本组42例，男31例，女11例，年龄34～84(平均59.35)岁，高分化者15例，中分化者13例，低分化者14例。同时取距肿瘤边缘>5 cm处作为正常黏膜组织。收集上述胃癌新鲜组织及正常胃组织，液氮保存，用于Western印迹及RT-PCR实验。

1.2主要试剂AMV第一链cDNA合成试剂盒购自大连宝生物(Takara)工程有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。兔抗人CyclinD1,CDC25B单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3Western印迹实验新鲜胃及胃癌组织，剪碎，加入苯甲基碳酰氟(PMSF)，提取总蛋白，十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，5% 脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TTBS)封闭液中封闭，一抗结合，过夜，室温洗膜，每次10 min，共3次，二抗结合，室温孵育2 h后曝光，观察结果。

1.4RT-PCR实验用细胞裂解液将各组细胞裂解，用TRIzol、氯仿和异丙醇提取各组细胞总RNA，逆转录成cDNA逆转录反应条件为：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。逆转录反应体系10 μl。6 μl的DNA Ladder 及20 μl扩增产物进行4%琼脂糖凝胶电泳(120 V，45 min)，采用ZF型 紫外透射反射分析仪摄像，采用Quantity one4.62软件统计各条带的积分光密度值，以积分光密度值比值分析各组间差异。β-actin上游引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，扩增片段大小为250 bp。CyclinD1上游引物为5′-CACACGGACTACAGGGGAGTT-3′，下游引物为5′-GCTCTTTTTCACGGGCTCCA-3′，扩增片段大小为313 bp。CDC25B上游引物为5′-GACAGCGACTTGCTGCTCAA-3′，下游引物为5′- ATAGGGCTGGGGGAATCCAT-3′，扩增片段大小为416 bp。

1.5统计学方法采用SPSS18.0软件进行独立样本t检验。

2　结　果

2.1Western印迹检测CyclinD1，CDC25B在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达CyclinD1，CDC25B在正常胃黏膜组织中的相对表达量分别为0.267±0.026、0.385±0.044，显著低于胃癌组织中的表达(0.649±0.052、0.945±0.059，P<0.05)，见图1。

2.2Western印迹检测CyclinD1，CDC25B与胃癌临床病理学特征的关系不同性别、年龄、分化程度、淋巴结转移，浸润深度CyclinD1，CDC25B蛋白表达见表1。CyclinD1及CDC25B在胃癌组织的表达均与淋巴结转移相关(P<0.05)。

1，2：正常胃黏膜、胃癌组织，下图同图1　Western印迹检测CyclinD1，CDC25B在胃组织中的表达

表1　Western印迹检测CyclinD1、CDC25B与胃癌临床病理学特征的关系

图2　RT-PCR检测CDC25B在胃黏组织中的表达

2.3RT-PCR方法检测CyclinD1，CDC25B在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达见图2，图3。CyclinD1，CDC25B在正常胃黏膜组织中的相对表达量分别为0.41±0.03、0.33±0.02，显著低于胃癌组织中的表达(0.85±0.05、0.92±0.06，P<0.05)，与Western印迹方法结果一致。

图3　RT-PCR检测CyclinD1在胃黏组织中的表达

3　讨　论

消化道肿瘤是我国发病率较高的恶性肿瘤，胃癌则是消化道的常见肿瘤。同其他恶性肿瘤一样，胃癌的发生是一个涉及多种致癌因素的复杂过程，最终导致正常细胞的异常增殖，形成肿瘤包块。CDC25B是CDC25家族中的重要成员，是一种双特异性蛋白磷酸酶，该家族在1986 年被证实为有丝分裂的启动因子〔2〕，家族还包括CDC25A和CDC25C。在各种致瘤因素的作用下，CDC25基因被活化，CDC25B蛋白合成增加，使CDK1去磷酸化，进而活化CDK1/CyclinB复合物，结果是使CDK1/CyclinB复合物由细胞质和中心体移到细胞核，通过正反馈作用，细胞核内的CDK1/CyclinB复合物完全激活，促进细胞周期由G2期向M期转化〔3〕。

陈彩萍等〔4〕应用免疫组化染色技术检测92例三阴性浸润性导管癌石蜡标本中的CDC25B 表达情况，并分析其与三阴性浸润性导管癌患者的年龄、TNM分期、淋巴结转移及预后间的关系，结果显示，三阴性浸润性导管癌中CDC25B存在高表达，与乳腺癌的发展及预后有关，提示CDC25B 有望在判断三阴性浸润性导管癌预后方面具有重要参考价值。张国君等〔5〕检测了CDC25B蛋白在膀胱细胞SV-HUC-1细胞系和膀胱癌BIU-87和T24细胞系中的表达，证实膀胱癌细胞系中CDC25B表达较高。肾癌及大肠癌中也有研究证实CDC25B高表达〔6，7〕。本实验提示CDC25B高表达可能与胃癌的不良预后相关。

细胞周期紊乱是肿瘤形成的重要决定因素，CyclinD1是调控细胞周期的重要蛋白，在许多组织的癌变过程中，均检测到CyclinD1的表达上调，目前认为，CyclinD1的主要作用是促进细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖〔8〕。在食管癌〔9〕、胆管癌〔10〕等消化道肿瘤中均提示CyclinD1高表达，与本实验检测结果一致。

1Russell P,Urse P.CDC25+functions as an inducer in the mitotic control of fission yeast〔J〕.Cell,1986;45(1):145-53.

2Bugler B,Aranta M,Aressy B,etal.Genotoxic-ativated G2-M checkpoint exit is dependent on CDC25B phosphatase expression〔J〕.Mol Cancer Ther,2006;5(6):1446-51.

3Kaneuchi M,Sasaki M,Tanaka Y,etal.Expression and methylation status of 14-3-3sigma gene can characterize the different histological features of ovarian cancer〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004;316(4):1156-62.

4陈彩萍,陆翔,邬万新,等.三阴性浸润性导管乳腺癌中CDC25B表达及其预后分析〔J〕.健康研究,2015;35(4):382-5.

5张国君,刘卓刚,张哲.膀胱不同细胞系中CDC25B蛋白表达及意义〔J〕.山西医药杂志,2012;41(7):652-3.

6于秀月,孔垂泽,张哲,等.CDC25B在肾癌细胞中的作用〔J〕.现代肿瘤医学,2014;22(8):1782-5.

7余月华,王琴,郑红英,等.CDC25B在大肠癌中的表达及意义〔J〕.宁夏医学杂志,2013;35(11)：1022-5.

8张砚,陈卫刚,郑勇.CyclinD1及相关基因在食管癌中的研究进展〔J〕.中华全科医学,2011;9(3):443-4.

9刘馨莲,李淑蓉,孙静,等.细胞周期蛋白在食管癌中的表达及意义〔J〕.中国实验诊断学,2012;16(7):1249-52.

10谷化平,黄勇,尚培中.细胞周期素D1和p16蛋白表达与胆管癌转移和预后的关系〔J〕.肝胆胰外科杂志,2013;25(3):219-31.