潘静娴, 宋韵琼, 崔丽洁*

(1.上海师范大学 生命科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海200234;2.上海市闵行区农业技术服务中心,上海 201109)

不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种,包括普通白菜、乌塌菜、菜薹、薹菜、分蘖菜和白菜型油菜6个变种[1],前5个变种为菜用种质,白菜型油菜为油用种质.不结球白菜在南方称为青菜或菘,北方称作油菜,是我国特有的、深受消费者喜爱的重要绿叶类蔬菜,有明显的杂种优势.在长江中下游各城市,它的年均消费量都占到全年蔬菜消费总量的30%～40%,仅上海全年播种面积就达1×104hm2[2].此外,北方也大量引种,而且近年来,已逐渐成为了世界性的蔬菜[3].无论是在生产还是研究领域,不结球白菜都受到了广泛关注,已在基因克隆、遗传图谱、DNA分子标记辅助育种、抗性育种等种质创新以及资源管理方面取得了很多进展[3-7].本文就不结球白菜在种质创新中的成果、研究进展、研究动态以及存在的问题进行了总结和综述,以期为不结球白菜种质创新和科研方向的选择提供一些参考和建议.

1 不结球白菜种质资源创新研究

1.1 耐热抗病虫和晚抽薹育种

不结球白菜是喜冷凉的两年生蔬菜,食用部位为营养体,但市场需求要求实现周年生产.因此,快速生长、耐热抗寒、耐抽薹、抗病虫害是种质创新的主要目标.耐热不结球白菜在南方地区夏季栽培蔬菜中占有重要地位.该地区夏季高温多雨时间长达3～4个月,极端高温可达40 ℃,因此耐热抗暑湿育种就成为重要的育种目标.通过诱变形成多倍体是获得抗性材料的重要方式[8],早在2002年,王亦菲等[9]用Co-γ射线照射不结球白菜小叶青干种子,经芽选获得了耐热突变体.而邓云等[10],徐丽娟等[11],韩业飞等[12]则是采用秋水仙碱分别诱导上海青、不结球白菜依伶和六合矮脚黄,也获得了耐热性好的同源四倍体材料.受多基因控制的耐热性状目前更多采用杂交育种方式得到,如江苏农科院培育的“东方2号”和“ 热矮001”,南京理想农业科技有限公司的“烤青”和“ 青伏令”,南京农业大学的“热火1号”和“热火2号”,南京绿领种业有限公司的“绿领1407”,上海市闵行区农业技术服务中心的“闵青101”[13],日本武藏野种苗园株式会社的“华王”“ 夏王”“ 华冠”和“金夏莳”等.此外,利用不结球白菜和耐热大白菜杂交选育抗热的不结球白菜也是一种新方法[4].

耐抽薹性是不结球白菜,尤其是普通白菜和塌菜两个变种的重要农艺性状.除制种外,抽薹越晚,生产性越好,食用价值也越高.利用杂交优势是选育晚抽薹品种的主要方法,如“京绿7号”是上海地方品种“五月慢”和北京地方品种“四月慢”的杂交后代[14],其农艺性状显著优于主栽品种“四月慢”和“五月慢”.此外,不少晚抽薹杂交品种相继育成,如江苏农科院培育的“青优”和“ 春佳”,北京京研益农科技有限公司的“春油1号”和“春油2号”等.它们在生长过程中,始终不抽薹[15].今后,继续选育适合冬春季栽培的晚抽薹品种仍是种质创新研究的方向之一.

春末到初秋的病虫害是不结球白菜生产中的主要难点.尤其是各种虫害,如菜青虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、黄曲条跳甲、小菜蛾和蚜虫等,如果不使用农药,将导致幼苗无法存活,成株失去商品价值.而农药的使用会带来食品安全问题,因此培育抗病虫,尤其是抗虫的不结球白菜,是育种研究的重要方向和难点.在抗芜菁花叶病毒(TuMV)问题上,南京农业大学早期利用系谱和母系选择相结合的方法,育成了“矮抗I号”,后来利用杂交育种选育了“矮抗”IV～VI.针对十字花科根肿病这个世界性病害,目前主要是对根肿病基因分子标记[5]、抗性生理及鉴定[16-17]和抗性诱导[18]的研究,抗性育种并不多见.抗虫育种虽然也有一些品种面世,如上海不结球白菜的主栽品种,由闸北区彭浦乡农科站选育的“上海605”,以及上海农科院选育的“新夏青”和“矮抗青”等,但采用常规种质创新技术的进展总体不大,许多研究者转而寻找转基因手段.

1.2 胞质雄性不育体系的研究

国外关于不结球白菜细胞质雄性不育杂交种选育的报道很少[19],国内的相关报道主要有隐性核不育两用系[20]、萝卜质不育系[21]、波里马油菜胞质不育系[22]和自交不亲和系[19]等,其中自交不亲和系是芸薹属中运用较广泛的杂交制种途径.由于不结球白菜属于常异花授粉作物,一般自交结实正常,因此在不结球白菜中很难获得优良的自交不亲和系,而要通过蕾期剥蕾授粉才能获得自交不亲和系,制种成本很高.因而,借助胞质雄性不育特性的种间转移就成为低成本利用杂交优势育种的重要途径,且目前取得了一定成果.庄静等[23]于1989年,在甘蓝型油菜中的细胞质雄性不育系中,通过种间杂交和回交,将不育性转入到普通白菜中,育成了普通白菜雄性不育系.后经配制杂交组合,育成了杂交新组合“8008”,品种审定名为“沪青杂1号”.它是第一个利用普通白菜胞质雄性不育系选育的杂交种.陈龙正等[24]利用1份胞质雄性不育的“苏州青”,转入到江苏农科院核心材料“90”中,也获得了不育系“90-2”,并进行了分子鉴定.沈火林等[25]将甘蓝型油菜中的胞质雄性不育特性转育到11个不结球白菜品种中,获得了3份异源胞质雄性不育系和其保持系,不育率达到了100%.另外,用秋水仙碱诱导二倍体后,再与不育四倍体杂交创建四倍体不结球白菜雄性不育材料,再转育也是获得不育品种的方法,如不育系“署1”[26],不育率达95%以上.更多不结球白菜不育材料的出现为不结球白菜杂种优势的利用提供了便捷的途径.

胞质雄性不育有一定的生长缺陷,如苗期低温黄化[27]、花器形态不正常[24]等,因此,通过进行不同水平的鉴定,筛选得到生长健壮、高不育性的不育系和保持系十分必要,前人也做了不少工作.邓晓辉等[28]对不结球白菜Polima胞质雄性不育系及其保持系的DNA基因组进行了random amplified polymorphism DNA (RAPD)分析,研究了两系间的遗传多样性,并在不育系中获得了一条稳定的sequence-characterized amplified region(SCAR)标记.周国林等[6]通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库,获得orf138和orf224开放阅读框序列,设计了两对引物,对小白菜和菜薹胞质雄性不育系和保持系进行了聚合酶链反应 (PCR)扩增,鉴定了该雄性不育为甘蓝型油菜不育类型.朱红芳等[29]利用叶绿素荧光技术,研究了不结球白菜雄性不育系和保持系不同时期的荧光参数,证实了不育系和保持系的植物学性状仅在生殖生长期存在差异.

1.3 特异性基因克隆和转基因抗性育种

1.3.1 特异性基因分离、克隆和表达分析

寻找和鉴定功能性基因,并进行基因克隆和遗传改良是分子育种的核心.国内不少研究者在这方面做了大量工作,克隆了不少基因,并对这些基因的功能进行了深度挖掘.在抗病基因方面,陈晓峰等[30]利用 rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技术,克隆了不结球白菜防卫素基因BcDF1.2的全长序列,经序列分析,证实了其与其他植物的防卫素基因和抗真菌基因有较高同源性.从被芜菁花叶病毒感染的不结球白菜叶片中分离和克隆的BcLRK01基因,在TuMV和高盐胁迫下,具有高表达特性[31].而从核盘菌感染的不结球白菜叶片中克隆的BcMPK4基因,在叶片中表达并参与了寄主对核盘菌的抗性[32].其后,更多抗病基因从不结球白菜中得到分离和克隆,功能也得到相应验证.耐热基因的挖掘也是不结球白菜特异性基因研究的重要内容.目前,研究者通过分离和克隆得到了不少与耐热的相关基因,如热激蛋白基因HSP家族中最保守的成员HSP70-1,已被从“抗热苏州青”中分离出来[33];而从3个耐热品种“高华青”、“ 苏州青”和“矮脚黄”中克隆得到了参与热应答的磷脂酶D(PLD)基因[34].除了抗性基因,其他特异性基因,如硝酸还原酶基因[35]、抗坏血酸基因[36]、锌指类超家族基因[37]、花色苷合成负调控基因[38]、花粉粒发育外壳蛋白基因[39],以及晚抽薹基因[40]等,也从不结球白菜中不断得到分离和克隆,并进行了基因特征的初步分析.综上所述,从不结球白菜中获得的特异性基因类型多样,包含抗病、耐热、品质等基因,但未见从不结球白菜中分离和克隆出抗虫基因的报道.

1.3.2 转基因抗性育种

不结球白菜生产中的病虫害,尤其是虫害一直是困扰生产的一个难题.生产中主要依赖农药来防治虫害,但也给食品安全带来很大风险,因此,研发抗病虫的不结球白菜种质是解决安全问题的根本途径.但从传统的抗性育种来看,并没有分离和克隆出自身抗虫的基因,因此,进行分子水平育种,如转基因育种就成为不结球白菜抗病虫种质创新的关注焦点.

多年来,利用基因工程技术进行不结球白菜定向改良取得了一定成就.转入的外源抗性基因主要有植物凝集素基因[41]、蛋白酶抑制剂基因[42-44]、芪合酶基因[45]、磷霉素和蛋白酶基因[46]和Bt基因[47-48],采用的方法有真空渗入、基因枪等,获得了普通白菜、菜薹等的转基因植株[49-50],也对转基因材料进行了鉴定[44,47,51].王忠华等[47]对Bt转基因抗虫青菜株系T2、T4的分析表明,虽然转基因株系的种子远小于原种“上海青”,后期生长又明显变慢,但具有发芽快和苗期生长快的优势,可见Bt基因的插入对萌芽和苗期性状相关基因的表达有较大影响.秦新民等[48]将CryIB基因转入白雪小白菜中,获得了转Bt基因小白菜,CryIB基因得到了表达.邓智年等[41]利用根癌农杆菌介导法,将豇豆蛋白酶抑制剂基因CPT1转入中脚黑叶和矮脚黑叶中,获得了转CPT1的中脚黑叶和矮脚黑叶小白菜,经分子鉴定,CPT1基因已整合到小白菜中,小菜蛾饲喂鉴定显示转化植株具有一定的抗虫性.尽管在20年前就育成了一些来自远源物种抗性基因的不结球白菜转化植株,对虫害和病害也有一定抗性,但始终还是停留在实验室和田间鉴定阶段,并没有进行安全性评价和生产.

1.4 遗传图谱和DNA分子标记辅助育种

农艺性状的选择是种质创新的基础,但大多数农艺性状是数量性状,它们不仅受多基因控制,而且还受环境影响[7].因此,通过表型来选择优良数量性状的传统育种方法存在很大不确定性.而分子标记辅助育种(MAS)将这些集中在一条染色体或几条染色体的某一段的多基因用DNA分子标记出来,并确定与之连锁的数量性状在染色体上的位置,再标记到遗传连锁图谱上,不需要等待花期或某一特定生长期来进行优良植株选择,从而为实现育种早期定向改良种质提供了途径.

目前已针对许多农作物构建了以分子标记为基础的遗传图谱,通过建立分子遗传图谱,可同时对许多重要农艺性状基因进行标记.在不结球白菜遗传图谱构建中,选择不结球白菜的作图群体是关键,关系到作图效率和时间长短.主要利用双单倍体(DH)群体和F2群体为作图群体[52-53],再将分子标记与连锁群以及遗传图谱匹配.目前,在不结球白菜遗传图谱的构建上已获得了不少成果,如GENG等[54]利用112个DH群体构建了不结球白菜遗传图谱,图谱覆盖长度为1923.75 cM,包含了14条连锁群和138个多态性分子标记.CHEN等[55]利用来自杂交小白菜“含笑”的127个DH作图群体构建了不结球白菜的遗传图谱,图谱覆盖长度973.38 cM,含10条连锁群和614个多态性分子标记.RAHUL等[56]利用了48个F2群体构建的不结球白菜遗传图谱,覆盖长度354.6 cM,包含9条连锁群和53个simple sequence repeats(SSR)标记.另外,采用 restriction fragment length polymorphism(RFLP)技术和改良的SSR标记技术来构建连锁群,并与模式植物拟南芥或者其他近缘种的遗传图谱进行比较,也是辅助不结球白菜遗传图谱构建的重要手段[52-53].

在构建遗传图谱的同时,利用分子标记辅助育种选择的亲本以及育成的品种也不断出现,从而为不结球白菜抗性杂交育种如抗病、抗虫、晚抽薹等创建了优良的自交不亲和系,也为大田生产提供了优质的品种资源.如GENG等[54]所用的DH作图群体“暑绿”,其母本是用分子标记技术从“矮脚黄”中选择的自交不亲和系.CHEN等[55]的研究材料杂交小白菜品种“含笑”,其母本“SW-13”是通过分子标记技术从“矮脚黄”中选择的自交不亲和系.RAHUL等[56]的F2作图群体,亲本“Barharl mandi”就是利用分子标记从“喜马拉雅”中筛选的.因此,随着对不结球白菜亚种的更多变种遗传图谱的构建,分子标记辅助育种将创建更多的新种质和自交不亲和系.

2 不结球白菜种质资源信息管理

获得优良育种材料是种质创新的基础和前提.在不结球白菜5个菜用变种中,普通白菜、乌塌菜、菜薹、薹菜4个变种,尤其是普通白菜均有数量庞大的品种.而且市场上同名异种或异名同种的品种普遍存在,品种资源较为混乱,此外,种质资源大多分散在全国各地的不同单位,或育种者,或生产者手中,要从中获得需要的种质资源或育种材料是比较困难的.因此有必要建立一个数据库管理系统,将不结球白菜种质资源进行信息化管理,通过互联网实现数据共享,而管理者也适时进行系统更新,就可以为育种工作者、生产者及其他专业人员提供一个不结球白菜的大数据平台,有利于不结球白菜种质资源的创新和利用.

不结球白菜种类繁多,资源的收集是建立数据库的基础,各国都在致力于遗传资源的收集与保护.中国是不结球白菜的原产国,在遗传种质保护上更具有重大的责任.王克娟等[57]对江苏省的不结球白菜种质进行了收集和整理,截止到1995年,全省的种质有196份,包括了不结球白菜菜用的5个变种.袁华玲等[58]在安徽省收集的116份不结球白菜种质,只有普通白菜和塌菜2个变种.侯喜林等[3]在20世纪80年代收集了白菜类地方种质200多份,并记录了26个农艺性状.宋韵琼等[59]在全国范围内收集了普通白菜品种资源600种,并进行了种质鉴定和数据库的创建.而建于1986年的中国国家种质库截止到2015年收集的不结球白菜种质已达到1392个,占总种质数据库资源的4.25%,其中有1215个进入了国家种质中期库[60].针对不结球白菜中优良品种的保护也取得了一定成果,如苏州市蔬菜研究所收集的各种“苏州青”就有80多份[61].随着种质的不断创新以及地方种质的不断出现,对不结球白菜种质的收集和鉴定将持续开展,种质的遗传信息如遗传图谱等的收录将是未来种质信息采集的新方向.

借助于网络技术将收集鉴定的种质资源进行网络化管理是现代种质资源管理的发展趋势.目前,建立数据库的种质主要是普通白菜、乌塌菜和菜薹3个变种,其数据库或是变种的独立数据库,或是含在蔬菜数据库中的一个子数据库,如普通白菜数据库就只有一个变种的品种资源,属独立数据库[59],而在中国作物种质信息网(CGRIS)、美国种质中心网络系统(GRIN)等大型数据库中,不结球白菜只是园艺作物子数据库的子数据库[62].除种质资源信息库外,也建立了一些不结球白菜的专题数据库,如病虫害数据库,LIU等[63]建立的白菜类蔬菜的害虫综合管理系统(IPM),就是一个包含白菜类蔬菜害虫发生特点到综合防治独立模块的主题数据库.将来有可能建立一个包含不结球白菜所有种质的数据库,并实现真正的全网共享,为种质创新、生产和科研教学提供一个快捷的资源信息平台.

3 结 语

不结球白菜是中国特有的蔬菜种质资源,不少种类已成为世界性的蔬菜,受到广大消费者的喜爱.中国在不结球白菜种质创新如细胞质雄性不育、分子标记育种以及抗病、晚抽薹育种等方面的研究取得了显著的成果,育成的一些种质在生产中成了主栽品种,但与一些进口种质如“日本花王”“夏王”“华冠”等青梗菜相比,在抗病虫、耐暑湿、生长整齐度、食用性方面还是存在一定差距.不结球白菜育种资源主要针对普通白菜、塌菜和薹菜,而在薹菜和分蘖菜上的利用相对较少.研究不结球白菜种质创新的单位主要集中在国内,尤其是南京农业大学和上海农科院在不结球白菜种质基因克隆和测序、分子标记辅助技术等方面的工作遥遥领先[3,23,29-30],并利用细胞质雄性不育和DNA分子标记辅助技术育成了不少新种质,有些已成为生产中的常规栽培品种.抗虫育种仍然是抗性育种中的难点,至今还没有重大突破,未来的育种应该以抗虫为主攻方向,有效解决不结球白菜从春到秋高温季节虫害严重的问题,实现减农药的不结球白菜生产目标.对丰富的不结球白菜种质资源的收集整理、鉴定和信息化管理应该加强,广泛收集农家品种资源,挖掘优良农艺性状,尤其是抗虫特性,最终建立一个全球范围内共享的不结球白菜种质数据库.