宋国庆 ，曹 禹 ，李 辉 ，马 克 ，赵雪莹 ，邹凯南 ，周怀谷

（1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；3.上海市刑事科学技术研究院，上海 200083）

微生物无处不在，生态环境中的微生物在地球化学循环中发挥着重要的生态作用，在人体内的微生物更是广泛参与免疫、消化、代谢等生理过程。早期的微生物研究主要依靠纯培养分离的方法，1998年，HANDELSMAN等[1]在研究土壤微生物时将环境中的全部微生物基因组当作研究对象并提出“宏基因组学”的概念，有别于传统的微生物研究，宏基因组学无须分离纯培养微生物，克服了传统研究中大多数微生物不能被大量培养、无法被测序的缺陷，更拓展了微生物的研究方法，可以从群落水平上揭示微生物及其相互之间的作用机理[2]。细菌是微生物的主要类群之一，在细菌中，主要存在 3种核糖体 RNA（5S、16S、23S），其中16S rRNA是细菌核糖体RNA的小亚基，该亚基的编码基因为16S rDNA，由于DNA容易提取并相对稳定，所以一般进行细菌群落结构或功能分析时均选取16S rDNA。随着分子生物学技术的快速发展，特别是高通量测序（high-throughput sequencing，HTS），又称大规模平行测序技术（massively parallel sequencing，MPS）的出现，生命科学领域掀起了新的技术革命[3-4]，16S rDNA的研究也进入了新的发展阶段。微生物16S rDNA作为种群分类的系统发育标记，使得非培养微生物的发现和研究成为可能，同时极大程度地促进了微生物学的发展[5]。

16S rDNA分子大小适中，由于功能上高度保守，而序列不同位置的变异速率不同，其进化具有良好的时钟特性，所以16S rDNA作为分子标记被广泛应用于细菌物种分类学的研究中[6]。16S rDNA由9个高变区和10个保守区构成，保守区反映细菌物种间的亲缘关系，可根据其序列设计细菌的通用扩增引物，而高变区则反映细菌物种间的差异，可根据其序列设计通用引物对细菌进行鉴定分类，虽然高变区无法准确地将所有细菌分类到种属水平，但依靠某些高变区仍可在特定的分类水平上预测细菌。例如：V3区在鉴定检测病原体的种属方面效果最佳；V4区为半保守高变区，在门类鉴定水平与完整16S rDNA序列的分辨率相近；V6区在鉴定炭疽病菌方面最为准确[7-8]。由于法庭科学领域更关注个体间的分类特征差异与检测鉴定时效的特点，无须过多关注基因功能相关的编码区序列，因此，16S rDNA在法医学检测中有很强的应用价值。基于16S rDNA保守区设计测序引物，建立各个可变区的复合扩增体系，利用HTS和生物信息学分析方法检测出生物检材中微生物群落的结构特征，是目前法医学领域研究的新热点。虽然多数工作还在实验阶段，但16S rDNA基因测序分析辅助侦查已经开始初步应用于法医实践工作[9]。早在20世纪，就有人提出尸体附近土壤微生物演替可以预测死亡时间[10]，发展至今，微生物学已经在死亡时间推测、死后毒（药）物分析、个体识别以及药物滥用等方面都展现出巨大的应用潜力和价值[9，11-14]。本文阐述了16S rDNA基因测序应用于法医学领域的研究方法和相关测序技术，综述了其测序在法医学领域的研究进展，探讨了16S rDNA在法医学中的应用价值和潜力。

1 16S rRNA的相关测序技术

1.1 第一代测序技术

以Sanger提出的双脱氧核苷酸链终止法和Maxam提出的化学降解法为代表的第一代测序技术在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174）[15]，VAINIO等[16]研究活性淤泥中的培养样本和未培养样本，从多个菌落中提取16S rDNA并通过Sanger测序法来检测微生物种群结构差异，发现未培养的样本中绝大部分16S rDNA序列是未知的，但当时基因数据库并没有这些序列信息，只能推断可能是变形杆菌的某种亚型，无法准确鉴别。其他一些对16S rDNA测序的研究中也有类似发现，但受限于当时的技术条件和数据库信息，无法做进一步研究[17-18]。第一代测序技术结果精确并且操作简单，促进了微生物在核酸序列检测上的发展，但由于其通量所限，无法满足微生物基因组学的测序需求[19]。

1.2 HTS技术

相比于第一代测序技术，HTS更适合微生物基因组学的研究，其通量更高，且无须进行微生物培养就可同时对样本中所有微生物进行检测，这使得对微生物群落进行细致分类和功能预测成为可能，HTS已迅速成为微生物基因组学的主要检测方法。454测序平台作为早期的HTS平台，通量和准确率远超于当时基于Sanger测序法的毛细管电泳[20]，同时有学者开始将微生物学与法医学鉴定结合[21-22]。KAKIZAKI等[23]利用454测序平台对溺水死者体内器官微生物16S rDNA位点的V7和V8两个高变区进行特异性扩增和测序，这也是首次使用HTS技术来进行溺水死亡的法医学鉴定。BENBOW等[24]通过454测序平台对16S rDNA基因扩增测序，发现水中腐败尸体表面的细菌在夏季和冬季有着明显的差异。近年来，其他通量更高、成本更低的测序技术平台迅速发展，454测序平台被逐渐淘汰到市场边缘，目前主流的微生物基因组测序平台有Illumina测序平台（美国Illumina公司）和Ion TorrentTM测序平台（美国Thermo Fisher Scientific公司），在16S rDNA的研究中均有所应用[25-26]。

Illumina测序平台的主要测序原理是边测序边合成（sequencing by synthesis，SBS）技术和可逆终止反应，这种方法很大程度上避免了同聚物测序时的相关错误和遗漏，在短时间内可以获得海量测序数据[27]。根据不同的研究目的，可选择最初的HiSeq及之后推出的 MiSeq、NextSeq、MiniSeq 和 NovaSeq 等测序平台。除了这些常规通用的平台外，美国Illumina公司还推出了专门适用于法医遗传学应用的MiSeq FGx测序平台。Illumina测序平台高精确度的数据和简化的工作流程非常适合法医微生物学的研究，基于该平台的Nextera XT DNA文库制备试剂盒缩短了文库制备过程，靶向扩增16S rDNA的V3和V4高变区并针对扩增子优化，得到微生物的系统发育分类信息。HABTOM等[28]比较了目前实验室常见土壤微生物分析技术的有效性和可靠性，靶向扩增16S rDNA的V4高变区，结果表明，在土壤微生物研究中，MiSeq测序平台的表现优于Ion PGMTM&Ion ProtonTM快速高通量测序（美国Thermo Fisher Scientific公司）和Roche 454超高能量测序（美国Roche公司），但得出准确结论仍然需要系统的多因素分析。

Ion TorrentTM测序平台进入HTS市场较晚，这一平台摈弃了主流测序仪器的光学系统而采用半导体测序，将化学信号转换为电信号，这种基于电化学检测的半导体测序平台凭借其测序效率和价格优势迅速成为主流HTS平台之一。至今为止，共发布了四种Ion TorrentTM测序平台，分别是Ion PGM（2010年）、Ion Proton（2012 年）、Ion S5（2015 年）和 Ion S5XL（2015年）。IonTorrentTM测序平台半导体测序技术简化了16S rDNA的研究过程，缩短了研究时间，其成本也是目前市场主流测序平台中最低的，为实验室提供了一种经济高效的选择[29-30]。基于该平台的宏基因组试剂盒Ion 16STMMetagenomics试剂盒可以多重扩增细菌16S rDNA七个高变区（V2～V9），从种属水平上获得微生物群落的信息。JUNEMANN等[31]最早在Ion TorrentTM测序平台上进行微生物学研究，通过靶向扩增16S rDNA的V6来比较两种不同治疗方案对慢性牙周炎患者龈下菌群差异和变化，从侧面验证了微生物学在疾病治疗评价中的重要性。YOUNG等[32]利用Ion PGMTM测序系统比较了针对不同靶基因的四种分子标记的重复性和辨识度，并设置了空白对照组，以区分不同地点的土壤样品。

1.3 16S rDNA的分析方法

16S rDNA作为目前法医微生物学的主要研究对象，其基本研究流程包括微生物DNA的提取、16S rDNA高变区的PCR模板、文库构建、模板制备、上机测序和测序数据的生物信息学分析。而数据分析流程主要包括：（1）测序数据的预处理。由于测序过程中各种影响因素会导致测序错误的发生，所以需要在分析之前排除或过滤这些数据，包括接头、引物及标签序列的去除，低质量序列过滤，序列去噪，嵌合体去除和数据均一化处理。（2）操作性分类单元（operational taxonomic unit，OTU）表的建立。OTU是指通过一定的距离度量方法计算两两不同序列之间的相似性，继而设置特定的分类阈值，进行聚类操作，形成不同的分类单元，在进行微生物多样性分析的时候，通常需要引入OTU，序列之间的相似水平大于97%[33]则划分为同一种微生物。通过将OUT的代表序列与相应的微生物数据库比对，进行物种注释并建立OTU的系统发育树。（3）后续分析。包括Alpha多样性（样本内）、Beta多样性（样本间）、物种丰度及群落结构等分析，从而得到微生物群落内和群落之间的相互联系和代谢特征等数据信息[34]。

2 16S rDNA测序在法医学中的研究进展

2.1 生物检材鉴定

判断犯罪现场遗留的生物检材类型和来源不仅是法医物证学的重要内容，更是重建犯罪现场的重要依据。实际检案中，人体生物性物质来源鉴定对作案过程的重建具有重要意义。传统上，生物检材的检测主要依靠免疫反应或酶学试剂盒等方法，但存在假阳性和假阴性的干扰。生物检材，如唾液、粪便及阴道分泌液等，含有大量的微生物，通过分析体液样本中微生物群落的种属、构成和丰度可以达到区分、鉴别不同体液的目的，所以，微生物检测有望成为常规技术的补充[35]。GIAMPAOLI等[36]基于各种生物检材的微生物特征，先通过16S rDNA鉴定某几种细菌的存在，然后通过实时定量PCR（real time PCR，RT-PCR）对微生物群落中某些基因进行特异性扩增并检测特定微生物信号，测定不同体液中这几种细菌的浓度，以达到体液鉴定的目的，其研究成功分辨出唾液和粪便中的阴道分泌液。随后，研究团队将这项成果商业化，形成ForFLUID试剂盒。经八个国家的八个不同实验室对5个样品（其中1个为阴性对照）进行盲测，均可对阴道分泌液样本准确识别，各实验室还使用自己的样本（包括唾液、粪便及阴道分泌液）进行验证，除了2个粪便样本外，其他样本均可判断是否含有阴道分泌液，证明了其稳定性和准确性[37]。HANSSEN等[38]通过HTS对6种相互对照的实验模型（纯净唾液、唾液+棉签拭子、唾液+胶条、皮肤唾液+棉签拭子、皮肤唾液+胶条、皮肤稀释唾液+胶条）、144个来自口腔和皮肤的微生物样本的16S rDNA基因进行测序并分析，以探索个体唾液微生物的稳定性和特异性，结果显示，微生物群落较好地区分了唾液和皮肤，而不同个体的唾液微生物具有特异性，交叉验证的准确率为94%。ZOU等[39-40]使用通用引物对阴道分泌液、唾液、粪便、鼻腔分泌液中的微生物进行扩增，发现阴道分泌液中可能存在特异性细菌，而后又基于16S rDNA测序技术分析了73份来自汉族人群的唾液、阴道分泌液和粪便样本，进一步证实了阴道分泌液中存在特异性细菌，这种细菌有望成为阴道分泌液鉴别的特异性指标。NAKANISHI等[41]使用PCR扩增检测口腔唾液中的唾液链球菌和变异链球菌，在20份唾液样品中均检测到唾液链球菌和变异链球菌，而在精液、尿液、阴道分泌液中或皮肤表面上未检测到此两种细菌，说明这两种链球菌可成为唾液鉴定的新的微生物标记。16S rDNA作为生物检材鉴定的生物标记仍有一定的缺陷，BRENIG等[42]认为，相比全基因组测序，16S rDNA减少了可被发现的微生物范围，而且对于微量检材效果较差。

2.2 个体识别鉴定

个体识别是法医物证学的两大主要任务之一，对案件侦查和嫌疑人排除有着重大意义。目前，个体识别主要依赖STR和SNP等DNA指纹技术，有研究[12，43-44]表明，“定居”人体的微生物作为人体的“第二基因组”，其群落结构特征在一定的时间内稳定存在，而不同的个体由于生活环境、饮食习惯等差异，导致个体所拥有的微生物群落特征各不相同，虽然某些微生物标记会随着时间逐渐丢失，但在一定程度上仍可以将微生物作为个体识别的生物学标记。STAHRINGER等[45]分析了264份唾液样品，发现个体间唾液微生物群落特征存在差异，而LEAKE等[46]的研究表明，通过唾液微生物可作为个体识别的一种补充，特别是同卵双生子的鉴别。SCHMEDES等[47]通过人工智能中监督学习的方法，在两年半内选取三个时间点分别对12名健康个体皮肤位点的微生物进行取样，而后通过16S rDNA基因测序鉴定其皮肤微生物群落特征，结果表明，14个皮肤取样位点中，3个位点的个体识别准确率高达100%。此后，该研究团队又分析了来自8名健康个体中3个皮肤位点微生物群落的分支特异性标记物，可判断、分类身体部位，准确率达94%。这种用于鉴定个体皮肤微生物群落的靶向分析新型方法，能准确地辨识出个体的皮肤微生物，可为个体识别提供一种新的研究思路[48]。

2.3 土壤检材鉴定

确定特定土壤检材的来源是法医实践工作的重要组成部分，通过分析转移到个体表面的土壤组成和特性，可辅助推断犯罪现场、提供嫌疑人线索等[49-50]。土壤中微生物种类繁多且数量庞大，对土壤微生物群落结构特征的分析有助于区分不同来源的土壤[9]。SENSABAUGH[51]提出土壤微生物群落分析用于法医学需要解决三个问题：（1）证明不同地方微生物群落的构成方式各不相同；（2）分析方法要将分辨性、稳定性和可靠性结合起来；（3）统计方法必须客观评估样本间的相似性和非相似性。XU等[52]采集了33份土壤样本，比较分析草地、森林土壤、北极圈土壤、红树林沉积土壤中的微生物群落多样性信息，揭示了在不同类型的土壤中微生物存的丰度和组成有一定的规律：在门水平，变形菌门在红树林沉积土壤中主要微生物（丰度＞2%的微生物）中占90%以上，而在沙漠土壤中只有30%；在科水平，外硫红螺旋菌科在红树林沉积土壤主要微生物为35%，但在其他几种草地中都不到5%。YOUNG等[32]针对土壤微生物不同类别进行分类扩增，分别扩增了 16S rDNA（细菌）、18S rDNA（真核生物）、转录间隔区序列（internally transcribed spacer sequence，ITS，真菌）以及植物叶绿体基因trnL的内含子片段，比较四种扩增子测序结果对不同地区土壤的分辨度，研究结果显示，16S rDNA、18S rDNA、ITS对于不同地区来源土壤均有一定分辨度，其中非细菌群落中的真菌，对不同地区的土壤区分度最高。YOUNG等[53]进一步评估了两种土壤剖面技术：真核生物（包括特定细菌，真菌和植物）18S rRNA测序技术和中红外（mid-infrared，MIR）光谱技术，对比六个法医模拟现场和七个参考地点的土壤检材，发现HTS技术补充了传统的MIR光谱土壤剖面图，能够提供统计学上更好的区分能力，表明了微生物学16S rDNA在法医学分析中的潜在应用。

2.4 死亡时间推断

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断是法医病理学研究中的难题，传统方法主要依靠尸体现象或尸体内源性指标，影响因素较多。死亡后，微生物参与了尸体的腐败过程，早期研究[54-56]证实，真菌群落的组成分布与尸体腐败有关，尸体周围微生物群落随时间不断演替，其变化参数可作为法医学死亡时间推断的辅助工具。OLAKANYE等[57]比较了动物尸体附近土壤和草地土壤，并设置阴性对照（只有土壤），通过16S rDNA基因测序鉴定细菌群落的构成，分析计算群落的香农指数和辛普森指数，研究发现，动物尸体附近土壤的pH值在一定时间内（180d）持续降低，而尸体细菌群落丰度和多样性在30 d内持续增高，并明显高于草地土壤和对照组，180 d后趋于草地土壤的构成，一定程度上证实了通过土壤微生物16S rDNA测序推断死亡时间的可能性。KAKIZAKI等[23]对溺水尸体血液、器官中微生物和尸体附近水域水体微生物进行16S rDNA位点基因测序，发现二者的微生物种类差异较小，这种新的分子生物学方法可为溺水死亡的确定提供证据支持。HYDE等[58]研究发现，尸体肿胀期前后两个时间点微生物群落从需氧菌为主转变为厌氧菌为主，尸体腐败过程中微生物群落结构在不停地演替变化。PECHAL等[59]的研究也证实了以上结论，在尸体腐败的各个阶段都有各自主要的微生物群落，随着时间演替，某些种属的细菌丰度和积温（某一时间内温度的总和）呈明显的负线性关系，并建立了相关数学模型推断死亡时间，结果表明，在科水平，弯曲杆菌科、肠球菌科和普雷沃氏菌科等17科细菌的丰度总和可以预测96%的死亡时间，但仍需要综合更多的样本量、地理因素和季节因素进行分析。

2.5 毒品成瘾机制

毒品成瘾是一种长期反复、持续地以强制性自我给药为特征的慢性复发性脑疾病，患者往往表现出对毒品的高度渴求和依赖。受经济全球化和社会信息化的影响，毒品成瘾已成为全球性的公共卫生问题。毒品成瘾的机制十分复杂，法医学者研究毒品的主要方向包括毒品的快速鉴定和成瘾机制等。研究[60]表明，肠道微生物和大脑之间通过“肠-脑轴（gut-brain axis）”在免疫、内分泌、营养吸收等方面有着千丝万缕的联系。肠道微生物在神经递质水平影响着个体大脑，与多种神经疾病相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、精神疾病和药物依赖等。VOLPE等[61]比较了可卡因使用者和非可卡因使用者人群的肠道菌群组成，发现可卡因使用者肠道微生物比非使用者的拟杆菌丰度更高，但厚壁菌的丰度更低。心理因素，尤其心理压力，是多种药物成瘾发展的关键性风险因素，而肠道微生物群落的改变可能导致个体心理应激反应和行为改变。从治疗的角度来看，肠道微生物群落的恢复可以促进个体精神疾病的康复[62-64]。KIRALY等[65]通过小鼠实验，给实验组的小鼠饮用的水源含有肠道无法吸收的抗生素，使其肠道细菌大大减少，结果发现，实验组小鼠大脑核团发生了改变，表现出对可卡因的敏感性显著增强。NING等[13]使用条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）模型研究甲基苯丙胺对大鼠行为的影响，通过收集粪便样本，对16S rDNA的V3～V4区进行HTS，结果显示，注射了甲基苯丙胺的大鼠肠道微生物群落的多样性和相对丰度更大，但厚壁菌显著减少，除此之外还发现丙酸杆菌属和分枝杆菌属被甲基苯丙胺抑制。近年来，肠道微生物群、大脑功能和个体行为之间的相互作用正逐步被证实[66]，而毒品成瘾机制和人体微生物的关系需要进一步探索。

3 展 望

目前，微生物基因组学已是法医学研究中的前沿热点，其“微生物指纹”在个体识别和体液鉴定中有着自己独特的优势，而其演替过程可以辅助推断土壤检材来源和死亡时间，也为毒品成瘾机制的研究提供新的思路。但16S rDNA基因测序在实际应用中仍存在一些不足和限制，宏基因组学是以整体微生物群落为研究对象，包括细菌、真菌、古细菌等，而16S rDNA基因测序仅分析了细菌群落的结构。此外，由于微生物容易受环境因素及研究过程中各种干扰因素的影响，研究方法的稳定性还有待提高，相关的生物信息学分析和统计方法尚不完善，其特异性和可靠性需进一步考证。不过，我们相信随着测序技术与生物信息技术的进一步发展与完善，系统的研究方法和有效的质量控制进一步成熟，微生物鉴定将有望成为法医学发展的一个新动力。