田靖

南部战区 疾病预防控制中心，云南 昆明650031

人类对蛇毒的认识起始于原始狩猎时期使用的毒箭，古希腊时期蛇毒还被制成“万能解毒药”用于解毒和战伤止血。随着科技的进步，蛇毒被越来越多地应用于医药领域。蛇毒组成具有高度的复杂性和多样性，对蛇毒研究的历史也是人类现代药理学建立的历史。随着“蛇毒组学”等新技术的运用，科学家们对蛇毒的成分和作用机理也有了越来越多的了解，蛇毒演化的研究也一直是遗传学家关注的焦点。

1 蛇毒组成和功能多样性

目前发现的毒蛇种类约有500 多种[1]，均属于新蛇类（即新蛇下目），分为蝰蛇科（Viperidae）、穴蝰科（Atractaspididae）、眼镜蛇科（Elapidae）和游蛇科（Colubridae）共4 科。

蛇毒由具有高度特异性的蛇毒腺体分泌，由大量的蛋白质以及超过900 种多肽类物质和代谢产物共同组成[2]。蛇毒蛋白的相对分子质量为6000～10 000，可分为具有酶活性和不具有酶活性2 类，大多数蛋白和多肽都以单体形式存在，单独发挥药理学功能，而一部分蛋白则通过共价键或非共价键与其他蛋白形成复合物，表现出更强的药理活性，大大增强毒素的致死能力[3]。电镜观察证实，毒素蛋白可以损伤血管壁的内皮细胞，使内皮细胞产生泡状结构，细胞核周围空间膨胀，从而破坏细胞膜。多肽类物质由2～15 个氨基酸残基组成，在响尾蛇和蝰蛇中含量较多。蛇毒中的多肽可结合于猎物的多种受体位点[4]，选择性作用于关键性酶、受体或离子通道，使其生物学功能改变，进而破坏中央和周围神经系统、心血管系统、肌肉神经系统和凝血系统的平衡[5]。蛇毒代谢产物包括嘌呤核苷酸及碱基、神经递质、胍基复合物、羧酸类化合物、胺类、单糖/双糖类以及氨基酸等，小分子代谢产物可能是蛇毒致死的主要原因，而含量最高的有机代谢物柠檬酸可以阻止蛇毒的降解。

蛇毒蛋白在每个独立科别内同源性较高，属于共同的蛋白家族，但一些特殊蛋白家族也在不同的蛇科普遍存在。这些毒素蛋白在氨基酸序列和丰度上存在差异，因此在不同蛇科内发挥不同的生物学功能。例如，蝰蛇科毒素中有大量酶活物质，影响凝血，具有轻微的神经毒素功能；眼镜蛇科家族毒素具有高度的神经毒素活性；穴蝰科毒素具有各种多肽类毒性，影响心血管系统；游蛇蛇毒具有一些类似于蝰蛇和眼镜蛇蛇毒的活性[6]。

2 蛇毒的合成与调控

2.1 蛇毒合成是环境适应性的昂贵代谢过程

蛇毒对于蛇类自身来说是一种珍贵的代谢产物，其合成过程高度消耗能量，Marshall 等对提取蛇毒后的美国蝮蛇进行了代谢率评估，发现在蛇毒消耗后自我补给的72 h 内整体代谢率提高了11%[7]。对于如此珍惜的资源，蛇类在长期进化的过程中也形成了以节约的方式使用蛇毒，如响尾蛇（Echisspp.）释放蛇毒的量是依据猎物体态大小来决定的[8]。虽然过量的毒液可以快速杀死猎物，但猎物死亡速度在提高毒蛇适应性方面是不必须的，没有成为蛇类演化的驱动力，因此大量毒液释放可能造成浪费，而节约使用蛇毒的方式被保留下来。

毒蛇还可以针对特定猎物生成特异性毒素，如在红树林蛇（Boiga dendrophila）蛇毒中分离得到针对鸟类的特有的denmotoxin 毒素[9]。

2.2 蛇毒合成调控具有周期性

蛇毒合成是一个动态调控过程，毒素成分可以随着生活环境[10]、饮食、生长季节和发育阶段[11]而改变。毒腺是改构的腮旁腺，是毒素合成的主要部位，主要由致密折叠的分泌上皮（epithelium）和多种类型细胞组成，包括腺分泌细胞（glandu⁃lar secretory cell）、富含线粒体细胞（mitochondriarich cell）、横向细胞（horizontal cell）和“黑暗”细胞（"dark" cells）等。毒蛇在释放毒液后易变得比较脆弱，因而需要一个高效的毒素生产系统，帮助其快速恢复“武器”效能，而这些大量富集的分泌细胞在快速再合成毒素蛋白及其他组分、及时补充毒液储备的过程中是必要的。

一个完整的毒素生产周期比哺乳动物唾液腺或胰腺蛋白的生产周期要长，分泌细胞通常经历由“静止期”进入“活跃期”，再进入“静止期”的循环过程。新毒素的合成伴随着毒素释放而启动，当接受到毒素合成的刺激信号后，毒素分泌细胞开始发生一系列形态学和生物化学方面的改变。研究发现，在蛇毒排出至以后的8 d 时间里，可见分泌上皮细胞增大、形态发生柱状性改变，粗糙内质网、高尔基体、亚细胞结构、分泌小体以及线粒体的细胞膜增加。蛇毒排出后4～8 d，分泌细胞合成活性最强，细胞内mRNA 浓度最高，毒素蛋白的合成逐步增加并趋于稳定，8 d 时达到峰值；随后，细胞合成活性降低，毒素逐渐在内腔中储存下来，毒腺重新回到“静止期”，直到下一次毒素合成激活。

2.3 蛇毒合成的不同步性

Currier 等的研究显示，蛇毒合成在某些方面是稳定遗传的，可能存在高度调控机制以确保蛇毒可以快速合成[12]。毒素生产周期中关键性毒素是在毒素合成起始阶段同步合成的。通过分析静止期、蛇毒抽取后0～1、0～3、0～7 d 主要毒素成分及蛇毒中的mRNA 发现，关键毒素mRNA 的表达在毒液释放后立刻处于全面活跃状态，并在3～7 d 达到转录高峰。利用反向HPLC-Mass 检测关键毒素蛋白的表达，主要毒素成分在毒素释放后迅速表达，含量和相对组成在毒素合成周期内较为稳定，并且初期合成毒素的活性与成熟毒素活性没有显著性差异。

有研究则认为，不同毒素在不同时间表达谱具有差异[13]，并非所有蛋白均在激活期合成[14]，说明不同毒素具有非同步合成的特点。毒腺处于“静止期”或“激活期”时，毒素蛋白的种类是不完全相同的。毒腺的“静止期”也已发现了绝大多数毒素蛋白种类，如富含半胱氨酸分泌蛋白（cys⁃teine-rich secretory protein，CRISP）、蛇毒金属蛋白酶（snake venom metalloproteinase，SVMP）、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase，LAAO）和解聚素（disinteg⁃rin）等。不仅如此，“静止期”还表达一些特异的蛋白，如C 型凝集素蛋白（C-type lectin proteins，CTL）和蛇毒丝氨酸蛋白酶（snake venom serine proteinase，SVSP）等在“静止期”的含量较“激活期”更为丰富，GPⅠb-BP 和促凝因子Ⅸ/Ⅹ蛋白则只在“静止期”出现，在蛇毒提取后1 d 这些蛋白就不再被检出。“静止期”的绝大多数毒素蛋白进入“激活期”后，表达更为活跃，蛋白种类也更为丰富。

毒腺中的非毒素蛋白可能与毒素蛋白的合成速度调控模式相关。在毒腺“静止期”，细胞质蛋白和内质网蛋白的合成种类增加，可能与毒素的合成和分泌过程相关。在毒腺“激活期”，与毒素分泌细胞合成和释放功能相关的蛋白质合成增加：如肌动蛋白等细胞骨架蛋白增多，与淀粉酶分泌相关；内质网相关蛋白二硫键异构酶表达增高，与内质网新合成蛋白的二硫键修饰和蛋白质的正确折叠有关；核糖体合成增加与蛋白合成、与mRNA 和tRNA 的转录起始相关；硫氧还蛋白的合成可能在特异蛋白的转录、翻译、翻译后修饰及蛋白相互作用等方面具有重要功能等。这些非毒素相关蛋白在“激活期”合成，保证了新蛋白和新毒素的合成、正确折叠、对细胞骨架的识别、正确的结构以及转录后的修饰等，在毒素合成和调控系统中发挥了重要作用。

2.4 毒素合成的转录后修饰

蛇毒中的mRNA 可以在蛇毒中异常稳定地存在，即使在含核酸酶及磷酸二脂酶的环境中也不被降解[15]，内质网分泌的微孔状小体（microvesicu⁃lar bodies）可能对RNA 具有保护作用。毒素的合成是蛇类毒腺的复杂代谢过程，比较合理的推测是，毒素相关基因的转录很可能在毒腺“静止期”就存在了，但调控却进一步发生在毒素生产周期的后续阶段。蛇毒中大范围识别到金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶，表明蛋白酶处理以及转录后修饰的发生。

不同的胞外信号肽诱导基因表达不同毒素，通过miRNA 调控mRNA 的翻译[16]，使得不同毒素可以非同步合成并独立分泌[17]，以避免细胞在同一时间生产所有毒素而造成压力。

3 蛇毒的演化机制探讨

自然界中动物毒素的功能主要是捕猎和防御。比如，蜜蜂及某些鱼类的毒素主要发挥防御功能，防御性毒素是简化和高度保守的，其主要作用是造成快速的、局部的剧痛；而捕食性毒素则更加复杂，在组成和生理学作用方面具有多样性[18]。食肉锥型蜗牛（cone snails）[19]能在捕猎和防御模式间迅速转化其毒素组分，毒素成分依据蜗牛的作用对象而调整：由防御引发的毒素包含大量瘫痪性毒素，作用于神经肌肉受体，能引起人体病理反应，对人类具有致死性；而由捕猎引发的毒素对于大多数人源性靶标则没有活性，不能引起人类病理反应。

蛇毒的进化至少有6000 万年[19]到1 亿7000 万年的历史[20]，是迄今研究最深入的生物毒素系统。蛇毒对于蛇类具有捕食猎物和防御的双重作用，捕食猎物是蛇毒的首要功能。蛇类为了能够在特定环境（特别是食物）下生存，须与猎物相互角逐、相互影响、共同进化：一方面，猎物期望可以逃脱蛇毒的作用，免于被蛇类捕杀，进化出一些对毒素具有抗体的物质；另一方面，蛇类为了提高对生存环境的适应性，不断优化调整毒素组成，以最少量、最有效的毒素消耗为代价达到捕获猎物的目的，毒素与猎物之间的“军备竞赛”持续进行。北太平洋响尾蛇（Crotalus o.orega⁃nus）的主要猎物是加利福尼亚松鼠（Otospermophi⁃lus beecheyi），Matthew 发现，松鼠血液中存在一种可以与蛇毒金属蛋白酶结合的物质，使松鼠具备了一种天然抵抗蛇毒毒素的能力，而这种抗性是可以随着地理差异的改变和蛇毒毒素成分的改变而调整的[21]。

生物毒素体现了生物的适应性，是趋异进化（divergent evolution）和趋同进化（convergent evo⁃lution）的很好的例子[20,22]。一些毒素基因被认为来源于参与重要的调控过程或具有生物活性的生理性蛋白基因的复制，并在毒腺中选择性表达。一旦某个特殊的基因被招募到毒腺中，额外的基因复制发生，使得蛋白具有新功能或亚功能化，典型的可以产生大量的多位点基因家族，编码不同功能和活性的毒素。同时，毒素也可以反向地从毒腺招募到正常组织中，一些毒素种类被发现在毒腺和组织中同时表达[23]。与组织中的酶类物质进化不同，蛇毒外显子的进化速度明显快于内显子[24]，快速进化的残基大多位于分子表面，以控制与靶标猎物体内的分子相互作用[25]。然而，毒素整体的进化速度是与毒素蛋白的转录组和蛋白质组的丰度相关的，高浓度的蛋白更可能被正向选择[26]。

毒素基因通过基因复制和加速进化的方式赋予毒素新的或协同的功能[27]，是新毒素基因进化的主要模型，但这一过程同时也可以反向进行。Casewell 等认为，基因缺失可以改变蛇毒的生物活性，从而使毒素更适应环境[1]。Martinson等认为，毒素表达的缺失并非是基因的降解，而是由顺式调控原件调节造成的基因表达下降引起的[28]。

现代科学技术的发展扩展了蛇毒研究的广度和深度，取得了令人欣喜的成就，但是还有很多问题尚未完全明晰。随着研究的不断深入，对蛇毒组成、合成机制以及毒素生物演化机制还会有新的发现，这将有助于人类对蛇毒的利用，更好地揭示生命奥秘。