刘冰江 霍雨猛 杨妍妍 吴雄

摘要：单倍体诱导技术对改良蔬菜品种、加速品种选育进程具有重要意义。本文就蔬菜单倍体离体诱导的主要途径、影响因素、染色体加倍技术及其在遗传育种中应用的研究进展进行了综述和讨论，分析了蔬菜单倍体研究中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。

关键词：蔬菜单倍体；离体雄核发育；离体雌核发育；双单倍体；遗传育种

中图分类号：S603.6-1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0151-07

Abstract Haploid induction technology is important for vegetable variety improvement and accelerating breeding process. In this article， we summarized the vegetable haploid induction in vitro from the main induction pathway， affecting factors， chromosome doubling technique and its application in genetic breeding. The existing problems and application prospect were analyzed， too.

Keywords Vegetable haploid； In vitro androgenesis； In vitro gynogenesis； Double haploid； Genetic breeding

单倍体是指具有配子体染色体组成的孢子体。在高等植物生长发育过程中，正常的单倍体世代（配子体世代）非常短，从受精后到发育至成熟植株都是二倍体世代（孢子体世代）。通过离体诱导途径产生的单倍体可以加倍获得纯合的双单倍体，而双单倍体可作为育种过程中的中间材料或亲本育成杂交种。由于单倍体技术能够快速、高效地纯化育种材料，在蔬菜品种改良、加速品种选育进程方面具有重要意义，因此越来越受到育种家的重视。蔬菜作物自然产生单倍体的频率极低，主要通过离体诱导的方法获得单倍体。目前已经有十几种蔬菜作物应用了单倍体育种技术，其中包括芸薹属、瓜类、辣椒、茄子、洋葱等。利用单倍体技术选育新品种已经成为蔬菜作物育种的重要方法[1]。

1 蔬菜离体单倍体诱导的主要途径

蔬菜离体单倍体主要通过离体雄核发育（in vitro androgenesis）和离体雌核发育（in vitro gynogenesis）两种诱导途径获得。离体雄核发育是指在特定离体培养条件下，通过对植物花药或花粉（游离小孢子）进行诱导处理，促使小孢子离开原来的配子体发育途径向孢子体发育途径转变，形成胚状体，从而获得单倍体的过程[2]。离体雌核发育是指通过离体培养未受精胚珠、未授粉子房或整个花蕾，使大孢子或雌配子体向孢子体途径转变诱导产生单倍体或双单倍体的过程。

Lichter（1982）[3]首次通过培养甘蓝型油菜游离小孢子，成功获得了单倍体再生植株。游离小孢子培养的主要优点是获得的再生植株单倍体及双单倍体率较高，避免了花药培养中可能的二倍体体细胞胚的再生，已经在十字花科、茄科和葫芦科等蔬菜中應用。

通过雌配子体诱导蔬菜单倍体研究可追溯到20世纪70年代。Uchiyama等（1971）[4]通过培养茄子未受精的胚珠诱导出了愈伤组织，并且观察到单倍体细胞分裂，但是没有获得单倍体再生植株。后来，许多研究者通过离体培养未受精胚珠、子房、花蕾得到单倍体，证明雌配子体的不正常发育形成愈伤组织或胚性组织，诱导了单倍体的产生[5]。

2 影响蔬菜单倍体离体诱导的因素

2.1 供体植株的基因型

无论是通过离体雄核还是雌核发育途径诱导单倍体，供体植株的基因型都是影响诱导率的重要因素之一。不仅不同蔬菜种类之间的诱导能力存在差异，同一种蔬菜不同品种之间的诱导率也存在明显差别。

基因型在甘蓝小孢子胚状体诱导中起着主导作用[6]。方淑桂等（2006）[7]用结球甘蓝胚状体诱导率高的材料与不易诱导胚状体的材料进行杂交，能明显提高不易诱导胚状体材料的出胚率；双交种与单交种相比更容易诱导出健壮的胚状体。在相同的离体雄核发育条件下，不同基因型辣椒的单倍体诱导率存在很大差异[8，9]。Zagorska等（1998）[10]发现85份番茄基因型的离体雄核发育中，53份形成了愈伤组织，只有15份获得了单倍体再生植株。庄飞云等（2010）[11]研究发现39份胡萝卜材料中只有6份形成了小孢子胚状体。

Bohanec和Jake（1999）[12]利用源自欧洲、美国和日本的39个洋葱育种材料的未授粉花蕾进行离体培养，单倍体诱导率最高的是源自美国的1个品种，美国的洋葱材料的单倍体平均诱导率分别是欧洲和日本的5倍和9倍。通过培养不同基因型西葫芦未受精胚珠获得单倍体的胚诱导率从0～48.8%不等[13]，然而Chen等（2011）[14]利用同一种培养基对西葫芦进行花药培养却获得了较好的诱导效果，这表明同一基因型的雄核和雌核发育诱导能力存在较大差别。

2.2 配子体的发育时期

雌雄配子体的发育时期是单倍体诱导能否成功的重要内在因素。在辣椒小孢子培养时，选择小孢子处于单核末期的花药，单倍体诱导率最高[15，16]。西葫芦小孢子单核中期和晚期的单倍体诱导效果较好[17]。番茄单核期的小孢子更适合单倍体诱导[18]。Gémes-Juhász等（2002）[19]进行黄瓜单倍体诱导培养时发现，雌花开放前6 h进行子房培养，胚的诱导率最高。谢冰等（2006）[20]对西葫芦未受精胚珠进行离体培养的研究结果表明，成熟及接近成熟的胚囊对诱导条件比较敏感，而成熟后的胚囊成员细胞在离体条件下较难启动分裂。Musial等（2005）[21]则认为发育早期（双核期或四核期）的胚囊比含有成熟大孢子母细胞的胚囊或成熟的胚囊更适合单倍体诱导。

2.3 培养基组成

不同种类的蔬菜单倍体诱导需要的基本培养基不同。在瓜类、茄科蔬菜单倍体诱导培养中，大多数使用MS为基本培养基或是在其基础上对某些成分进行少量修改[22-24]。王烨等（2015）[25]对黄瓜未受精胚珠进行诱导培养时发现，硝态氮和铵态氮含量接近的培养基中胚的诱导率较高。十字花科蔬菜小孢子培养大多采用NLN、葱蒜类蔬菜大多采用B5等基本培养基[26-31]。

培养基中的激素成分对于单倍体的诱导起着十分重要的作用。Kumar等（2003）[32]认为B5基本培养基中添加2.0 μmol/L 2，4-D和1.0 μmol/L BAP最适合黄瓜花药胚性愈伤组织或胚的形成。黄瓜未受精子房或胚珠培养时，培养基中加入0.04 mg/L TDZ（thidiazuron，苯基噻二唑脲），胚状体的诱导率最高[33]。胡萝卜未受精胚珠培养时，培养基中加入IAA促进了胚状体的形成，而加入2，4-D 和6-BA促进了愈伤组织的形成[34]。一般来说，激素水平偏低，难以诱导雌核发育；水平偏高，又易诱导体细胞的愈伤组织，抑制雌核发育。Martinez等（2000）[35]用多胺代替生长素和细胞分裂素促进了洋葱单倍体的诱导。脯氨酸和甘氨酸对黄瓜离体雌核发育具有明显的促进作用[18]。

培养基中的蔗糖浓度是影响单倍体诱导的另一个重要因素。蔗糖不仅是培养基中的一种碳源，还是一种渗透压调节剂。朱守亮等（2009）[36]在对甘蓝进行小孢子培养时发现，培养基中添加13%和15%的蔗糖时能够诱导出胚状体，而添加10%和17%的蔗糖时没有诱导出胚状体，说明蔗糖浓度过低或过高都不适于甘蓝小孢子胚胎的发生。在对分葱和普通洋葱的种间杂交种进行未授粉花蕾诱导培养时，培养基中的蔗糖浓度为7.5%时诱导效果较好[28]。培养基中较高的蔗糖浓度对大部分植物离体雌核发育是有利的，但在对西葫芦的未受精胚珠进行离体培养时，30 g/L蔗糖的胚状体诱导效果最好，过高的蔗糖浓度反而抑制胚状体的诱导，浓度达到90 g/L时没有产生胚状体[12]。

2.4 温度胁迫处理

植物单倍体培养时用适宜的温度胁迫对材料进行预处理，可有效改变雌雄配子体的发育途径，诱导发育状态从配子体途径进入孢子体途径[13，37，38]。研究证实利用黄瓜胚珠和子房进行单倍体诱导培养时，先在35℃预处理3 d，单倍体胚的诱导率和植株再生率明显提高[18，31]。花椰菜小孢子在32.5℃下预培养处理1 d，显著提高了胚状体诱导率[39]。番茄花蕾在4℃低温下预处理2 d，然后在10℃处理9 d，胚的诱导效果最佳[40]。而胡萝卜花药在4°C处理12 d，胚的诱导效果最佳[41]。

3 单倍体染色体加倍

3.1 自然加倍

从理论上讲，小孢子只携带供体植株一半的染色体，由小孢子诱导培养产生的再生植株应该都是单倍体，但实际情况是再生植株中出现了不同比例的二倍体。研究发现，通过小孢子培养技术获得的二倍体再生植株率在不同的蔬菜作物间存在明显差异。如在甘蓝型油菜中，小孢子再生植株的自然加倍率为10%～26%[42]；在大白菜小孢子培养再生植株中，多数基因型经自然加倍的二倍体植株可达50%以上[43]。白菜型油菜小孢子培养自然加倍的二倍体再生植株率超过70%[44]。芥菜单倍体诱导过程中，再生植株自然加倍率仅为4%～6%[45]。不同基因型胡萝卜小孢子培养获得的再生植株自然加倍率范围较广，从5.6%～100%不等[46]。茄子小孢子培養再生植株的自然加倍率能达到60%[23]。雌核发育途径诱导单倍体研究中同样存在着自然加倍的现象。Kiekowska和Adamus（2010）[34]通过对胡萝卜未受精胚珠进行离体诱导培养得到的再生植株中97.7%是二倍体，其中45.9%是纯合的双单倍体。可以看出，植物单倍体培养中广泛存在着自发形成双单倍体的现象。可能是通过核内重复复制或核融合导致了染色体的自然加倍[47]。

3.2 诱导染色体加倍

虽然单倍体诱导过程中普遍存在自然加倍，但大部分频率较低，有必要利用有效措施进行人工染色体加倍。诱导单倍体染色体加倍的最常用化学药剂是秋水仙素。作为一种微管抑制剂，秋水仙素能够在适宜浓度下抑制纺锤丝形成，使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能正常分向两极，从而诱导染色体加倍。当在培养基中添加0.3%秋水仙素处理芦笋单倍体7 d，得到了最好的诱导效果[48]。羽衣甘蓝单倍体试管苗的加倍以秋水仙素浓度70 mg/L、处理时间9～11 d为宜[49]。张振超等（2013）[50]对3种甘蓝类蔬菜诱导的单倍体植株采用200 mg/L秋水仙素浸根处理20 h，二倍体诱导率达到50%以上。Lim和Earle（2009）[51]用500 mg/L的秋水仙素处理甜瓜单倍体植株外植体节间12 h，加倍效果较好。Lotfi等（2003）[52]则用750 mg/L的秋水仙素处理甜瓜单倍体茎尖3 h，得到了较好的加倍效果。

秋水仙素与植物微管蛋白亲和性较低，加倍时通常浓度在毫摩级。还有一些化学除草剂如甲基胺草磷、安磺灵和氟乐灵等在诱导染色体加倍时也具有很大的潜力，它们诱导染色体加倍的机理和秋水仙素相同，但与秋水仙素相比，这些药剂与植物微管蛋白的亲和性较强，所用浓度在微摩级时即具有相似的加倍效果，而且毒性更低，但目前发现仅在少量蔬菜种类的单倍体诱导加倍过程中有效。用安磺灵和氟乐灵处理甘蓝单倍体的试验结果表明，氟乐灵的加倍效果更好[53]。利用甲基胺草磷、安磺灵和氟乐灵三种药剂在对洋葱单倍体进行加倍时也取得了较好效果，所用剂量仅为50 μmol/L[54]。

4 单倍体在蔬菜遗传育种研究中的应用

4.1 用于转基因供体

单倍体胚及其再生植株等都可以作为转基因受体进行遗传转化，且转化后获得的植株不存在基因显隐性问题，可经加倍获得纯合的转基因株系，并能稳定遗传。刘凡等（1998）[55]利用大白菜小孢子胚状体为受体获得了抗除草剂T0代植株。Tsukazaki等（2002）[56]利用甘蓝双单倍体材料的下胚轴作为受体，建立了稳定的根癌农杆菌介导的转化体系。Cogan等（2001）[57]利用青花菜、花椰菜、甘蓝、羽衣甘蓝的双单倍体下胚轴作为受体，建立了发根农杆菌介导的转化体系，后代没有发现明显的分离。

4.2 构建遗传连锁图

DH（双单倍体）群体在遗传上具有绝对的纯合性，是构建分子标记遗传图谱的重要材料。利用DH群体构建遗传连锁图可以大大提高基因定位、作图的准确性。由于所有的等位基因都是固定的，可以无限繁殖，并且保证长期性利用，因此DH群体是永久性群体。Pradhan等（2003）[58]利用源于印度芥菜杂交F1代的DH群体构建了高密度的连锁图。Kuginuki等（1997）[59]利用DH群体确定了与大白菜抗根肿病基因连锁的三个RAPD标记，为构建遗传连锁图奠定了基础。张晓芬等（2005）[60]利用大白菜F1代游离小孢子培养建立的DH群体，筛选获得了346个AFLP多态性标记，构建了大白菜遗传连锁图谱。张立阳等（2005）[61]以大白菜高抗TuMV白心株系91-112和高感TuMV桔红心株系T12-19为亲本建立的小孢子培养DH群体作为图谱构建群体，构建了包含406个标记、10个连锁群的遗传图谱。王晓武等（2005）[62]利用芥蓝和青花菜杂交F1经小孢子培养获得的DH 群体，获得了337个AFLP标记，构建了一个甘蓝类作物较高密度的遗传连锁图谱。Minamiyama（2006）[63]、Mimura（2009）[64]等利用辣椒DH群体，构建了基于SSR标记和AFLP标记的连锁图。

4.3 数量性状的遗传分析

DH群体是数量性状分析的理想材料，可以重复进行检验，特别适合于品质、产量等数量性状的分析。DH群体是永久纯合的，不需要通过反复自交、回交，而且可以减少群体规模，大大减少了环境造成的遗传分析误差。

张树根等（2008）[65]利用牛角椒DH群体对果实性状进行了遗传力分析，认为影响单果质量和果实横径的多基因间存在互补作用，控制果肉厚度的多基因间可能存在互补，而果实纵径、果形指数各自的基因间无互作关系。张晓伟等（2009）[66]对来自抗病亲本Y195293和感病亲本Y177212的DH群体的TuMV抗性进行QTL分析，共检测到3个QTLs，分别位于R03、R04和R06连锁群上。缪体云等（2008）[67]利用结球甘蓝DH群体建立了主要农艺性状的数量性状主基因+多基因混合遗传模型，分析了8个主要农艺性状的遗传效应，认为数量性状主基因遗传率中最高的是最大外叶柄长，外短缩茎长和中心柱长的主基因遗传率较高，叶球高主基因遗传率最低；多基因遗传率中最高的是叶球高度，开展度受环境影响最大，而外叶柄长受环境影响最小。

4.4 突变体及抗病材料筛选

通过传统的人工诱变育种方法选择突变体时往往受到许多因素干扰，存在着性状的显隐性关系，很难做到正确选择。而且为了增加选择几率，往往群体过大，很容易漏选或者误选。单倍体只有一套染色体组，不存在基因位点的显隐性，一旦发生突变就会在植株性状上表现出来，隐性基因也可以直接表达，非常有利于对突变体进行筛选。Zhang和Takahata（1999）[68]利用小孢子培养系统，结合紫外线照射处理，筛选出了大白菜抗软腐病突变体。Kuzuya等（2003）[69]筛选出了抗霜霉病的甜瓜单倍体植株。Valkonen等（1999）[70]从源于花药培养的马铃薯品系中筛选出了GAs合成途径部分受阻的矮化突变体。Jensen等（1999）[71]在青花菜DH群体中评价霜霉病抗性，筛选出抗霜霉病的青花菜植株。Vicente等（2002）[72]从甘蓝中筛选出了抗黑腐病3号生理小種的DH系。获得的这些突变体，若是双单倍体，可以直接得到性状稳定的新种质；若是单倍体，需进一步通过加倍得到稳定的纯合二倍体后，才能直接应用于育种。

5 结语与展望

在过去的几十年中，蔬菜单倍体诱导及应用技术取得了较大进展，开发出一些重复性好、诱导率高的培养程序，培育出许多有潜力的亲本材料和新品种。但是仍有许多蔬菜种类尚未取得成功，而且已取得成功的蔬菜种类中也有一大部分无法应用于实际育种中。另外，某些蔬菜单倍体诱导率比较低，部分结果重复性不好，无法形成育种规模。今后有必要通过进一步研究优化影响单倍体诱导频率及加倍成双单倍体的各种条件，深入探讨参与单倍体植株形成的分子生物学和细胞生物学机制，相信将来会大大降低单倍体诱导的基因型依赖性，建立起优化的双单倍体加倍技术体系，从而与常规育种和现代分子育种技术紧密结合。

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