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1.贵阳中医学院药学系，贵州 贵阳 550002；2.贵州师范大学分析测试中心, 贵州 贵阳 550001；3.黔南州瓮安县人民医院, 贵州 黔南 550400

钝药野木瓜(StauntonialeucanthaDiels ex Y.C.)属于木通科野木瓜属植物，俗称绕绕藤、五叶木通、八月瓜，主要分布在贵州、四川、安徽、江浙和两广一带，具有祛风止痛，利尿消肿的功效，对风湿痹通、小便不利和水肿疗效显著[1]。该药材被2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载，作为野木瓜藤入药，但仅有性状描述[2]。在长期研究抗病毒中药和民族药的过程中，采用HIV-1蛋白酶和HPLC法[3]，发现钝药野木瓜95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在100 μg/mL时，对HIV蛋白酶的抑制率达44.3%，进一步的文献调研发现，钝药野木瓜化学成分及含量研究未见报道。2015 版《中国药典》同属植物野木瓜(S.chinensisDC)以苯乙醇苷类成分荷苞花苷B作为指标性成分进行质量控制[4]。本课题组参照药典方法对黔产10批次的钝药野木瓜药材中荷苞花苷B进行定性和定量研究，发现含量为5.91～39.39 μg/g，荷苞花苷B需低温存放，长时间暴露在空气中，含量有所下降，其标准品溶液低温存放超过24 h后，易产生杂质峰[5]。一些学者对野木瓜(S.chinensisDC)中的木犀草素、绿原酸、齐墩果酸和熊果酸的含量进行了报道[6-8]，而同属植物化学成分研究发现野木瓜(S.chinensisDC)[9]、六叶野木瓜(S.hexaphyllaThunb.Dence.)、五指那藤(S.obovatifoliolasubsp.intermedia)、尾叶那藤(S.obovatifoliolasp.urophylla)和黄腊果(S.brachyanthera)藤茎中常分离出羽扇豆醇和羽扇豆酮等多种羽扇豆烷型化合物[9-11]。体内外研究证实，羽扇豆醇具抗炎、抗疟疾、抗癌等作用[12]。羽扇豆酮对单纯疱疹病毒(HSV)和非洲猪瘟病毒(ASFV)具有抗病毒活性，对HSV-1和HSV-2具有很强的抗病毒抑癍作用[13]。为明确钝药野木瓜药效物质基础，实验开展了钝药野木瓜化学成分研究，建立HPLC法同时测定羽扇豆醇和羽扇豆酮的定量分析方法，为该药材的监督、质控和相关药品、保健品的开发研制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker AM-400和500 MHz核磁共振波谱仪(TMS为内标)；GC-MS 5973型气相色谱质谱联用仪(美国HP公司)；1100型高效液相色谱仪( 美国 Agilent)；梅特勒-托利多超声波清洗器(METILER-TOULEDO)；ME104 电子分析天平(瑞士梅特勒)；R-200旋转蒸发仪(瑞士布奇公司)；SHZ-DⅢ循环水式真空泵(上海予英仪器有限公司)；ZF-1三用紫外分析仪(上海电光分析)。

1.2 材料 TLC和柱色谱硅胶分别为GF254和200-300目硅胶 (青岛海洋化工厂分厂)；反相硅胶为ODS DM 1020T (日本富士硅胶公司)；Sephadex LH-20 (GE 公司)。羽扇豆醇、羽扇豆烷均来自为本植物(乙酸乙酯萃取)分离纯化所得，结构经波谱学(ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR)分析鉴定，以HPLC面积归一化法测定其质量分数均大于96%。洗脱剂均为工业重蒸品，甲醇、乙醇、磷酸(分析纯，重庆茂业化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水(超纯水)。钝药野木瓜药材于2014年4月采集于贵州省遵义市，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为钝药野木瓜的地上部分，凭证标本保存于贵阳中医学院中药化学教研室(标本号：2014/SL)。

2 方法与结果

2.1 化学成分研究

2.1.1 药材前处理 干燥钝药野木瓜藤茎 3 kg,粉碎后用70%的甲醇溶液(料液比为 1∶3)加热回流提取3次，每次1 h，合并浸提液后减压浓缩，回收甲醇至无醇味，再用乙酸乙酯萃取，浓缩，得浸膏(45 g)，经硅胶柱(柱长×内径=75 cm × 5.5 cm )色谱进行分离。以石油醚-乙酸乙酯(40∶1 → 0∶100)进行梯度洗脱，最后用氯仿-甲醇(1∶1)混合液及纯甲醇下柱，得 35 个流份(fr.1～ 35)。

2.1.2 化合物的分离纯化 在fr.3，即 石油醚-乙酸乙酯 25∶1 部分(112 mg)经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(1∶1)为洗脱剂，纯化得到化合物 1(27 mg)；fr. 18，即石油醚-乙酸乙酯 20∶1～18∶1部分(106 mg)经反相硅胶柱层析，以甲醇-水(5∶5 → 10∶0)梯度洗脱，在 8∶2 洗脱部分析出结晶，用甲醇多次洗涤结晶，石油醚-丙酮重结晶得化合物2(19 mg)；fr.26，即石油醚-乙酸乙酯(15∶1 ～ 12∶1部分(363 mg)经硅胶柱层析分离，用石油醚-丙酮(30∶1→1∶1)梯度洗脱得到 12 个流份，其中fr.5 ～ 6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇洗脱分离纯化得到化合物 3(26.7 mg)；fr.30，即石油醚-乙酸乙酯10∶1～9∶1部分(163 mg)经硅胶柱层析，用氯仿-丙酮(40∶1→1∶1)洗脱，并经石油醚-丙酮重结晶得到化合物 4(25.2 mg)

2.1.3 化合物的结构鉴定 化合物 1 白色结晶(丙酮)，mp 170～172 ℃，分子式为C30H48O; ESI-MSm/z447 [M + 23]+;1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) 数据与文献[14]对照基本一致，故鉴定化合物 1 为羽扇豆酮。

化合物 2 白色针晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z488 [M]+,1H-NMR (CDCl3,500 MHz)、13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定该化合物2为3β-乙酰基齐墩果酸。

化合物 3 白色针状结晶(石油醚-醋酸乙酯), mp 210 ～ 212 ℃,分子式为C30H50O, TLC检识遇硫酸-甲醇溶液加热显紫红色, Lieberman-Burchard反应为阳性。EI-MSm/z426 [M]+，1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)数据与文献[16]对照基本一致，故鉴定化合物 3 为羽扇豆醇。

化合物 4 白色簇晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z456 [M]+,1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定该化合物4为齐墩果酸。

2.2 羽扇豆醇与羽扇豆酮的含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适应性 色谱柱为Ocean C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相：100%甲醇；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；紫外检测波长：210 nm；进样量为20 μL。对照品与样品中的羽扇豆醇和羽扇豆酮色谱峰相互分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，对照品和钝药野木瓜样品的HPLC色谱见图 1。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取羽扇豆醇对照品12.930 mg和羽扇豆酮对照品23.625 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，制成浓度分别为0.5172 mg/mL和0.945 mg/mL对照品贮备液。分别精密吸取上述对照品贮备液适量，加甲醇溶解并稀释，摇匀，制成羽扇豆醇和羽扇豆酮质量浓度分别为0.0517 mg/mL和0.0945 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取钝药野木瓜干燥带叶茎枝药材粉末(贵州都匀，过4号筛，50℃烘干)约1.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，用移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称重，超声提取30 min，待冷却后，称重，用甲醇补足减量，经4000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 标准曲线的考察 分别精密吸取上述两种对照品贮备液1、5、10、15、20、25 μL，按2.2.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标进行回归，得羽扇豆醇回归方程为Y=20.026X-6.1885(r=0.9995，n=6)，进样量在0.5172～12.93 μg范围内线性关系良好；回归方程为羽扇豆酮Y=7.6074X+2.6331(r=0.9992，n=6)，进样量在0.945～23.625 μg范围内线性关系良好。见图2～3。

2.2.5 精密度试验 分别精密吸取2.2.2项下对照品混合溶液20 μL，按2.2.1色谱条件各连续进样6次，测定峰面积，计算RSD分别为0.9%和0.3%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一批钝药野木瓜粉末(贵州都匀，过4号筛)6份，每份1.0 g，按供试品溶液的制备方法制备溶液，取供试品溶液20 μL进样，在上述色谱条件下进行分析，根据峰面积代入回归方程计算质量，得羽扇豆醇和羽扇豆酮RSD分别为1.2%(n=6)和0.8%(n=6)。

2.2.7 稳定性试验 精密称取钝药野木瓜粉末(贵州都匀，过4号筛)约1.0 g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，室温下放置，取供试品溶液20μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，分别测定峰面积。结果羽扇豆醇和羽扇豆酮峰面积的RSD分别为2.0%和1.5%。表明12 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取钝药野木瓜粉末(贵州都匀，过4号筛)约0.5 g，各加入对照品适量，按2.2.3项下方法制备样品溶液，分别吸取20 μL进样分析，测定羽扇豆醇、羽扇豆酮的含量，计算加样回收率。见表1。

表1 钝药野木瓜加样回收率结果

2.2.9 样品分析 取贵州省3个地区钝药野木瓜的茎和全株，8个地区钝药野木瓜的全株，打成粉末(过4号筛)精密称定1.0 g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，记录峰面积，外标一点法计算药材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量。实验结果见表2～3。

表2 钝药野木瓜药材不同采收部位两种三萜含量检测结果 (n=3)

表3 贵州8个地区钝药野木瓜药材中两种三萜含量检测结果 (n=10)

3 讨论

3.1 实验条件的优化 实验考察了甲醇-水、乙腈-水3个不同比例为检测体系，结果发现目标峰出峰较晚，甚至不出峰，而甲醇-水(98∶2)首个目标峰出峰时间接近1 h，用乙腈替换也没明显改善出峰时间，而用纯甲醇作为流动相时，两个目标峰羽扇豆醇、羽扇豆酮的出峰时间明显缩短且分离效果好，故选择了纯甲醇作为流动相。

3.2 样品处理方法的选择 实验考察了不同溶剂(甲醇、乙醇、氯仿及氯仿-甲醇)作为提取溶剂，结果发现甲醇作为提取溶剂提取率相对较高，氯仿-甲醇(1∶1)及氯仿次之，乙醇作为提取溶剂时目标峰分离效果不好，故选用甲醇作为提取溶剂，同时本实验也考察了不同浓度甲醇(100%、90%、80%、75%、65%)，不同提取方法(超声提取法、回流提取法、冷浸提取法)，不同提取时间(0 min、30 min、40 min、50 min、60 min)，不同料液比(15倍、25倍、35倍、45倍体积)，最终确定以100%甲醇为提取溶剂，超声提取30 min，料液比为25倍时样品提取率相对较高且操作简便，故为最优处理方法。

3.3 样品含量测定 由表2可知，钝药野木瓜全株植物中的羽扇豆醇含量均高于纯茎部位，可能该植物的叶子含有较大量的羽扇豆醇成分，而羽扇豆酮的含量受植株部位的影响较小；由表3中结果显示，羽扇豆醇的含量受植物生长环境的影响较小，但不同产地还是存在差异，贵州丹寨地区的钝药野木瓜中羽扇豆醇含量最高，为0.0113 mg/g；羽扇豆酮的含量差异较大，植株受生长环境因素影响较大，并且贵州贵定地区的钝药野木瓜中羽扇豆酮与总三萜的含量最高，分别为0.0708 mg/g和0.0794 mg/g。贵州省8个不同产地、10批次的药材中，丹寨和贵定地区样品的羽扇豆醇和羽扇豆酮含量最高，分别为0.0113 mg·g-1和0.0708 mg·g-1。

实验首次从钝药野木瓜中分离、纯化和鉴定出4种五环三萜化合物，并建立HPLC法同时测定钝药野木瓜药材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量，分析方法简单、可行，研究结果为钝药野木瓜药材的开发利用提供科学依据。

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