郑春辉，杨永敏，吴春贵，梁凯乾，田晓红，魏妮娜

(遵义医学院 珠海校区生物工程系，广东 珠海 519041)

虎耳草(SaxifragastoloniferaCurtis)，别名：老虎耳、佛耳草等，属于虎耳草目，虎耳草科，虎耳草属。其是贵州省重要的民族苗药药材，具有保肝、抗炎、镇咳等功效[1]，其含有岩白菜素、贝格宁、原儿茶酸、没食子酸和槲皮素等主要成分[2]。研究表明虎耳草不仅具有抗肿瘤活性[3]，还具有抗菌、抗氧化活性[4]，在贵州民间广泛用于治疗湿疹、中耳炎、痔疮肿痛等疾病[5-6]，得到了医生和患者的广泛认同。虎耳草在我国多个地区均有生长，但是品质却参差不齐。有研究表明，贵州各地虎耳草药材中岩白菜素含量在0.4%左右，远高于《贵州省中药材、民族药质量标准》中规定的最低含量限度0.080%，而且没食子酸的平均含量为0.121%，虎耳草的质量较好[7]。一直以来，虎耳草原材料主要依靠野生资源，随着需求量增加，野生虎耳草产量已不能满足市场的需求，从而导致在收购时出现品种混杂情况，严重影响到了药材的质量稳定和临床用药的安全。

过去常用的药材性状鉴定方法和理化鉴定方法等传统的手段在操作过程中，要么可靠性差，要么操作繁琐。随着分子生物学的发展，多种分子标记技术，如内部简单重复序列标记(inter simple sequence repeat,ISSR)[8]、扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism,AFLP)[9]、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD )[10]和内部转录间隔区 (inter nal transcribed spacer,ITS)[11]等均被运用于药用植物的鉴定研究。其中ITS 序列分析技术凭借方便、可靠和准确等优点受到人们的推崇和关注[12]。ITS序列是rDNA转录间隔区序列，分为ITS1和ITS2，其作为非编码区，承受自然选择的压力小，长度虽然较为保守，但核苷酸序列的变化较大，可以为研究提供较为详尽的遗传学信息。DNA条形码技术是Hebert在2003年通过一段或几段很短通用的标准目的基因DNA序列，对物种的分析及鉴定的一门技术[13]。现已成为鉴定生物界发展最快速的研究方向之一[14-16]。DNA条形码不仅准确性高，而且操作简单快速高效，同时可利用信息平台和互联网实现统一管理和共享[17]。中国学者首次提出将ITS2序列作为药用植物标准DNA条形码，并建立了以ITS2序列为主的药用植物类中药材DNA条形码鉴定体系。

本实验采集贵州苗药虎耳草为样本，提取总DNA，通过PCR技术和测序技术获得虎耳草的ITS2序列，分析虎耳草及其近缘种序列，为虎耳草药材的鉴定提供一个简单快速无误的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 苗药虎耳草均采集于贵州省，所有采集的样品虎耳草药材都是来自经硅胶快速干燥的新鲜叶子，共6份样本，其余的序列在GenBank中下载(见表1)。

表1样品的采集来源

样品名称物种登陆号采集地点采集类型虎耳草1号SaxifragastoloniferaKY425697贵州省思南县熬家沟组野生虎耳草2号SaxifragastoloniferaKY425698贵州省思南县岩石河村野生虎耳草3号SaxifragastoloniferaKY425699贵州省思南县岩石河村野生虎耳草4号SaxifragastoloniferaKY425700贵州省黔东南浪洞镇后寨村野生虎耳草5号SaxifragastoloniferaKY425704贵州省赫章县兴发苗族乡野生虎耳草6号SaxifragastoloniferaKY425705贵州省凯里市又庄小区A种植小虎耳草SaxifragastoloniferasmallKC004032.1湖南怀化Genbank下载沼泽虎耳草SaxifragahirsutaLM654415.1德国马丁大学Genbank下载喜马拉雅虎耳草SaxifragabrunoniLN812370.1喜马拉雅Genbank下载西藏虎耳草SaxifragatibeticaLN812551.1西藏Genbank下载青藏虎耳草SaxifragaprzewalskiiLN812508.1青藏Genbank下载爪瓣虎耳草SaxifragaunguiculataLN812561.1-Genbank下载金星虎耳草Saxifragastella-aureavarLN812539.1-Genbank下载理塘虎耳草Saxifraga.litangensisLN812471.1-Genbank下载小短尖虎耳草SaxifragamucronulataLN812484.1-Genbank下载红毛虎耳草SaxifragarufescensLN812521.1-Genbank下载镜叶虎耳草SaxifragafortuneivarLN81248.1-Genbank下载萨维尔虎耳草SaxifragatayloriiKF196351.1-Genbank下载狭叶虎耳草SaxifragaangustataLN812351.1-Genbank下载

1.1.2 实验试剂 植物DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购自北京金鑫天佑生物科技有限公司，6×DNA上样缓冲液、GoldViewTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker购自北京庄萌国际生物基因科技有限公司，ITS 序列扩增引物购自北京六合华大基因科技股份有限公司，引物4rev、引物5afwd和Pfu酶购自上海生物工程技术服务有限公司，相应操作按照说明书上进行。

1.1.3 实验仪器 琼脂糖水平电泳仪和凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)，PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)，MeastroNano Drop微量分光光度计(Novazym Distribution)。

1.2 方法

1.2.1 样品虎耳草的采集及其总DNA提取 采集新鲜虎耳草，叶片用酒精擦拭风干，用硅胶密封干燥。取干燥后的样品用液氮研磨成粉末状，称取40 mg加到1.5 mL的离心管中，再利用天根生化科技有限公司植物DNA提取试剂盒提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增和测序 配制反应体系为25 μL，其中2Pfu master mix为12.5 μL，4rev为1 μL，5afwd为1 μL，DNA模板为4 μL，ddH2O为6.5 μL。配制体系所用到的引物为通用引物(见表2)，PCR仪循环程序设置为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃复性1.5 min，72 ℃延伸7 min，共计30个循环。

表2 DNA条形码引物

序列名称引物名称引物序列ITS5afwd(上游)5'-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3'4rev(下游) 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

PCR扩增完成后，取2 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察胶上是否有预计的条带，将有条带的PCR产物送去广州生工生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.3 数据分析及提交到GeneBank数据库 获得测序结果后，利用DNA MAN软件进行序列的拼接，把低质量序列和引物部分去除，利用Sequin软件把所拼接好的虎耳草序列的正确信息输入到该软件中，得到sqn文件。再以附件的形式发送到GenBank的邮箱中，申请序列登陆号。后续将所测序列用MEGA5.0分析对比，计算出种内和种间最大遗传距离K2P，建立NJ系统发育树。

2 结果

2.1 PCR扩增产物的检测结果 应用ITS的通用引物进行PCR扩增后，对扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图1)，结果所有样品均得到ITS片段扩增产物，片段大小约在750 bp，PCR产物用凝胶电泳检测有单一清晰条带，无拖尾现象，可送去测序公司进行PAGE纯化和双向测序。

Marker：DL2000 Marker；1～6：虎耳草1～6号。图1 PCR扩增产物凝胶电泳图谱

2.2 虎耳草ITS碱基序列及片段的特征结果 经过序列比对，6个样品虎耳草ITS序列碱基完全相同，ITS总长度为680 bp，ITS1长度为285 bp，ITS2的长度为236 bp，序列碱基详见图2。

虎耳草近缘种的ITS2片段长度范围为236～243 bp，GC含量范围为48.1%～58.1%。由于6个样品虎耳草的ITS序列碱基完全相同，故所得到的ITS2序列也就一样，长度均为236 bp，GC含量均为50.6%；贵州苗药虎耳草的GC含量与同种小虎耳草的GC含量一致，说明种内无差异，与其它近缘种的ITS2片段在序列长度和GC含量相比，均有差异(见表3)。

6个贵州苗药虎耳草样品与近缘种ITS2序列进行种类种间变异位点分析(见图3)，共有124个变异位点，其中虎耳草与同种小虎耳草之间无变异差异。

2.3 虎耳草及其近缘种ITS2序列二级结构的比较 利用ITS2数据库预测得到虎耳草及近缘种的二级结构，由结果(见图4)可以看出，贵州虎耳草的ITS2序列二级结构均由一个以哑铃型中心环及4个螺旋区所构成，而近缘种的二级结构由一个中心环螺旋区构成，狭叶虎耳草Saxifragaangustata、镜叶虎耳草Saxifragafortuneivar等臂环的大小都有所不同，每个螺旋区的角度也有所不同；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ上径环大小、数目、臂环角度、位置均有差异，结果表明：运用ITS2二级结构可以直观地将虎耳草及其近缘种区分开来。

图2 苗药虎耳草ITS碱基序列

表3 ITS2序列特征

物种名长度(bp)A(bp)T(bp)C(bp)G(bp)CG含量(%)Saxifragastolonifera1^62365757635950.6Saxifragastoloniferasmall2365757635950.6Saxifragahirsuta2385150706757.6Saxifragaangustata2394753697058.1Saxifragamucronulata2384853686957.6Saxifragabrunonis2394856676856.5Saxifragaunguiculata2394659676655.6Saxifragastella-aureavar2394657666956.4Saxifragalitangensis2394857656855.6Saxifragatibetica2394957656855.6Saxifragaprzewalskii2394957656755.2Saxifragafortuneivar2385169556349.7Saxifragataylorii2435373576048.1Saxifragarufescens2416063595948.9

图4 虎耳草及其近缘种ITS2序列的二级结构

2.4 建立虎耳草及其近缘种ITS2序列的NJ系统发育树 对所采集的虎耳草与GenBank中下载的13条虎耳草的近缘种ITS2序列，构建虎耳草的NJ发育树。构建出来的发育树结果(见图5)：虎耳草属物种主要聚为两大枝，其中贵州苗药虎耳草Saxifragastolonifera和小虎耳草Saxifragastoloniferasmall单独聚为一小枝，与狭叶虎耳草Saxifragaangustata、喜马拉雅虎耳草Saxifragabrunonis、理塘虎耳草Saxifragalitangensis、沼泽虎草Saxifragahirsuta等近缘种聚为一大枝；而沼泽虎草Saxifragahirsuta与虎耳草Saxifragastolonifera的亲缘关系比狭叶虎耳草Saxifragaangustata、喜马拉雅虎耳草Saxifragabrunonis等的亲缘关系更近。贵州苗药虎耳草Saxifragastolonifera和近缘种呈现出明显的单系性，可以很直观地区分开。由此可以看出，ITS2序列可以准确有效地鉴定虎耳草及近缘种。

图5 虎耳草及其近缘种ITS2序列NJ系统发育树

3 讨论

虎耳草植物在贵州分布相对广泛，而且贵州虎耳草的药用成分含量比较高，品质较好。近几年随着滥采滥挖，导致野生药材资源锐减，并且在市场上出现以次充好等现象，这些对临床用药的有效性和安全性会造成很大的隐患。虽然传统的形态学鉴定、化学鉴定等方法在药材的鉴别中发挥了一定的作用，但对于鉴定外观形态相似的近缘种药材，存在很大困难。而DNA序列信息可以区别发生变异的物种，通过建立一个数据库，可快速有效鉴定大量的标本，物种身份通过实验技术鉴定，不需要经验丰富的专家，这些均体现了DNA条形码具有高准确、高效率、且不受人为因素的影响等优点。有研究人员成功利用DNA条形码技术对来源不同产地药材臭蒿[18]、艾纳香[19]、白及[20]、柴胡[21]、板南根[22]、鸡骨草[23]等药材进行鉴定分析，结果表明DNA条形码技术用于药材鉴定已经相当成熟。因此，DNA条形码技术在药材分类、标准制定、药材流通和市场管理等实际应用中具有重要的价值。

近年来，ITS2序列在DNA条形码技术研究鉴定和生物分类学中比较热门[24]，该研究在药材植物的鉴定技术中的准确性和稳定性是当前的重点。研究发现，ITS2序列在植物的研究中，扩增率高和物种间鉴定效果强，同时ITS2序列还具有鉴定条形码序列的潜力[25]。本研究在贵州采集6份不同地点的虎耳草基源植物利用DNA条形码获得ITS2序列，结果表明，黔东南地区和黔西地区采集的虎耳草ITS2序列无碱基差异，6个采自贵州不同地方的虎耳草样品属于同一个种的虎耳草。通过变异位点分析发现贵州苗药虎耳草Saxifragastolonifera与小虎耳草Saxifragastoloniferasmall之间无变异位点，说明种内无变异，属于同一个种下的不同变种，需要进一步研究。苗药虎耳草与其他近缘种之间存在相应的变异位点；并且与其近缘种ITS2序列的长度和GC含量均存在差异。在比较苗药虎耳草及其近缘种的ITS2序列的二级结构时，苗药虎耳草二级结构的中心环呈哑铃型，近缘种的二级结构的中心环呈椭圆形或圆形，可以很直观地将虎耳草与近缘种区分开来。

实验结果表明，以ITS2作为DNA条形码对贵州虎耳草和其近源种的鉴定研究，不仅准确性高，而且操作快速简单。本研究不仅为虎耳草的分类以及该药材的质量控制和近缘种混伪品鉴定提供科学依据，还为虎耳草临床用药的安全提供了保障，同时将获得的贵州苗药虎耳草的ITS2序列，成功上传GenBank数据库，得到登录号，实现资源共享。但是该研究也还存在不足之处，该方法只能用于贵州虎耳草和其近缘种的鉴定，无法对贵州不同地区的虎耳草和小虎耳草进行更细的分类和其药理活性进行鉴别，后续将结合RAPD技术和理化成分分析，进行更进一步研究。

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