金潇　周松　胡建敏　赵明

南方医科大学珠江医院器官移植中心，广州市炎症与免疫性疾病重点实验室（广州 510280）

终末期肾病为各种慢性肾疾病持续进展的共同结局，与透析相比，肾移植不仅为终末期患者提供了更好的生存机会，也能改善患者的生存质量，是治疗终末期肾病最有效的手段。在过去20年间，多种免疫抑制药物的问世和免疫诱导方案的建立显著改善了手术后的短期疗效。然而，超过1年的长期移植物存活率仍然只有小幅增长［1］，许多因素，例如移植物质量，缺血再灌注损伤，细胞和体液排斥反应，免疫抑制药物的肾毒性，都可引起早期肾小管萎缩和肾间质纤维化（IF/TA），并影响长期疗效。因此，需要一种方案，既能有效预防排斥反应的发生，同时可以保护肾功能和肾单位结构完整性。间充质干细胞（MSC）在细胞和抗体介导的炎症模型中的免疫调节特性突出表明了其在实体器官移植应用的潜力［2］。本文总结了近几年的研究进展，就MSC在肾移植中的应用的具体方法以及可能的作用机制作一综述，从这些实验研究获得的数据进一步了解MSC在肾移植应用的安全性，可行性和疗效。

1　MSC的特性

MSC可以在体外和体内分化成各种组织，包括骨骼、软骨、脂肪等。此外，在不同诱导条件下，MSC可以转分化多种具有不同谱系特征的组织细胞；大量研究表明，MSC具有低免疫原性及免疫调节功能。除了上述特性，当MSC表面的相应受体与来自损伤组织的信号分子相结合后，可以应答并迁移到受损组织［3］。这个过程称为归巢。其归巢机制涉及几种重要的相关因子［4］。如CXC趋化因子家族及 CD44［5⁃6］，迁徙开始时，MSC 首先黏附于血管内皮细胞，在那里它们穿过内皮并进入损伤的组织基底部［7］。目前关于上述因子的具体作用途径及作用机制尚未完全了解。另外，有研究［8］发现，某些炎性因子如肿瘤坏死因子（TNF）和IL⁃1可使归巢相关因子表达上调，这提示不同状态下的炎症反应可能影响MSC的归巢以及治疗效果。

2　间充质干细胞应用于肾移植的方法

2.1间充质干细胞种类的选择MSC可于骨髓及以外的多个组织中分离培养，例如外周血，结缔组织，脂肪组织，脐带等。目前研究中常用的MSC包括骨髓MSC、脐带MSC以及脂肪MSC等。最近，PELEKANOS小组的研究［9］比较了在相同条件下培养的成年骨髓来源，肾和心脏来源的MSC的免疫表型，基因表达，多能性和免疫抑制潜力。发现所有MSC均表达参与免疫调节，归巢和组织修复，但是观察到不同种类MSC基因表达和途径有明显差别，提示不同种类的MSC在功能上有特异性。因此，尽管从各种组织分离的MSC具有相似的特征，但探明不同来源的MSC功能上的差异，使未来研究不同类型疾病时可以选择合适的MSC，以提高效率，仍是值得我们关注的问题之一。

2.2间充质干细胞输注方式及剂量目前MSC在器官移植患者中的输注剂量、方式及时机尚未统一，目前大多数研究偏向于通过静脉注射约（1.0 ～ 2.0）× 106/kg的剂量［10⁃12］；REINDERS的研究［13］入组了6例在移植术后4周或6个月时经程序性活检发现存在排斥反应或间质纤维化/肾小管萎缩增加的患者，通过静脉注射两剂自体骨髓MSC，剂量为（1.0～2.0）×106/kg；间隔时间为1周，结果输注耐受性良好，无严重不良事件报告，且在注射MSC的12周后发现有5例受试者监测到单核淋巴细胞增殖能力的下降。提示移植接受者的自体MSC治疗在临床上是可行和安全的；PERICO的研究［14］选取了两例肾移植术后的患者，在术后1周通过静脉注射的方式输注自体骨髓MSC，剂量为（1.7～2.0）×106/kg，通过穿刺活检均未发现排斥反应发生，且临床观察患者移植功能稳定。并发现MSC具有调节免疫功能。上述临床实验纳入样本量较少，且未设立标准对照组，随访时间不长，根据结果，注射MSC后未发生输注后相关不良反应，提示静脉注射MSC的短期安全性值得肯定，但其疗效及应用后长期安全性仍不得而知。TAN等［12］的研究通过患者在术中和两周后静脉注射骨髓来源的自体MSC（1.0～2.0）×106/kg。并将患者随机分为使用标准剂量CNI组及低剂量（80%标准剂量）CNI组，其中标准剂量组53例，低剂量组52例。并设立对照组59例使用巴利昔单抗，以评估在接受肾移植的ESRD患者中自体MSC注射与巴利昔单抗的疗效。患者1年随访表明，与应用巴利昔单抗相比，MSC治疗可以更快恢复肾功能，有较低的急性排斥发生率和机会性感染率。所有患者移植功能均恢复良好。实验结果提示，与常用的免疫诱导治疗方案相比，MSC疗效更好，而不良反应发生率较低，尤其是机会性感染风险，在随访期间，也没有发现MSC影响肾脏成活的线索，这也证明其应用方式的安全性。并且，有研究［15］提示，MSC与CNI药物有互补作用，可减少CNI药物的用量，从而减少药物肾毒性。

除了经静脉注射，由于肾移植手术过程中需行血管吻合，这也为直接经肾动脉输注MSC提供了绝佳的机会，陈正等［16］对比经移植肾动脉输注组和经髂总静脉输注组两组之间每头猪移植肾及肺脏所含阳性细胞数（间充质干细胞数），发现经移植肾动脉途径输注，在移植肾的定植、分化的细胞数明显高于经髂总静脉输注途径，同时他们入组10名受者，分别在术中、术后1周和术后1个月共3次输注自体骨髓MSC。首次在术中经移植肾动脉输注，细胞数为5×106/kg；术后1周和1个月经外周静脉输注，细胞数1×106/kg，并且使用较低初始剂量的FK506 0.04～0.05 mg/（kg·d），发现该输注方式及剂量是安全，可行的，并且自体骨髓MSC联合低剂量CNI能获得理想的移植肾功能，在一定程度上诱导移植免疫耐受。徐璐等［17］通过移植过程中经移植肾动脉以输血器输注自体骨髓MSC，剂量为5×106个；移植过程中、移植后3个月内密切观察可能发生的并发症及移植肾功能恢复情况。发现3例患者骨髓MSC输注过程顺利，移植肾血流良好，无不良事件报告，未发生移植肾排斥反应，移植肾功能恢复顺利。以上结果说明经移植肾动脉输注骨髓MSC具有临床可操作性。笔者认为，相比于静脉注射，经肾动脉注射为单次注射，可精准的将更多的MSC输注入移植肾内，使之归巢到移植肾内的MSC数量更多，但只能在术中输注，术后如需再次输注，目前仍采用静脉输注。另外，也有学者认为直接经移植肾动脉注射会增加血管栓塞的风险，上述研究样本量偏小，系统偏差影响较大，这也提示我们需要更大规模的动物和临床实验，来验证其输注后不良反应，摸索出适合剂量，从而建立安全的治疗方案。

总之，目前关于MSC在肾移植手术患者的输注方式和有效剂量仍未有一个公认的标准，根据目前已发表的相关研究结果显示，106量级在肾移植术后患者的应用中其安全性已被证实，是目前大多数研究倾向的初始注射剂量，输注方式和次数则仍无定论。关于MSC肾移植手术患者的输注方式和有效剂量，需要更大规模的随机对照实验去进一步探索。

2.3MSC的预处理发生损伤的组织往往处于大量炎性因子聚集，营养不足的缺氧以及氧化应激环境，在注射MSC后，由于它们的归巢特性，使得其暴露于上述环境中，导致MSC治疗疗效受到影响甚至引起MSC的早期死亡。预处理MSC似乎是一种新的措施，通过增强MSC的归巢，抗氧化凋亡等能力，以达到加强其疗效的目的。目前常用的预处理方法包括体外缺氧处理、添加生物活性因子共培养、遗传基因修饰等。ZHANG等［18］建立AKI大鼠模型注射缺氧处理后MSC，发现与对照组常氧处理的MSC相比，缺氧预处理的MSC显着增加缺血性肾组织中的血管密度，细胞凋亡和组织学损伤也均有明显改善。此外，接受MSC的动物血清中肌酐和BUN降低，特别是缺氧预处理组，体外证明其旁分泌作用也显著增强。由此其得出结论缺氧可以通过抗凋亡作用，清除ROS和促进血管生成来增强MSC的功效。此外，经缺氧预处理的大鼠骨髓MSC（BM⁃MSC）显著增加 HIF⁃1α和 CXCR4的表达，并使得MSC归巢能力得到提升［19-20］。与对照组相比，预处理MSC在肾缺血模型中表现出更活跃的归巢特性和更长的保留时间。XINARIS等用胰岛素生长因子1（IGF⁃1）预处理小鼠BM⁃MSC，发现预处理MSC归巢能力显著增加。相反，诸如胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）和TNF⁃α的预处理没有增强MSC的归巢。而接受IGF⁃1预处理的MSC的小鼠管状上皮细胞坏死及管状组织结构变化也较轻。CAI等［21-22］使用阿托伐他汀预处理MSC后经静脉注射到缺血性AKI小鼠模型体内，发现经预处理的MSC显著降低了损伤后血清肌酐和血尿素氮水平，此外，与其他组相比，预处理MSC组的肾小管细胞凋亡被抑制。由此他们认为阿托伐他丁预处理显著改善氧化应激，抑制炎症反应，增加MSC的生存能力。必须指出的是，目前实验还处于动物实验的阶段。其具体机制还不甚明了，需要进一步的研究，包括更多的临床试验，以实现MSC的常规应用作为治疗肾损伤的新模式。

经过基因修改的MSC可以诱导加强某些蛋白质的分泌，参与细胞归巢，增殖和存活。核因子红细胞相关因子2（Nrf2）可以调节活化抗氧化酶，在抗氧化应激当中有着不可替代的作用。MOHAMMADZADEH⁃VARDIN 等［23］通过重组腺病毒将表达Nrf2的基因在重组在MSC中，并将重组MSC植入AKI大鼠模型。发现重组MSC可以改善肌酐和尿素水平，改善AKI大鼠的肾功能。病理也提示肾小管损伤改善。由此他们认为重组MSC可通过表达抗氧化因子达到更好的治疗效果，另外，通过特定基因重组后的MSC可以增加脂质运载蛋白2等的分泌［24］，减轻氧化应激反应，减少细胞凋亡。通过修饰MSC自身基因，增强包括基质细胞衍生因子⁃1（SDF⁃1）及其细胞受体CXCR4 的合成，则可显著提高MSC的归巢效率，从而有效改善肾功能［25］。其他的还包括胰岛素样生长因子（IGF⁃1）［26］，血管内皮生长因子（VEGF）等［27］，通过基因修饰的MSC增加上述物质的合成，从而强化其抗氧化，抗炎，抗凋亡和归巢能力。由此看来，由于移植肾早期微环境差，注射后MSCs的有效性降低，在缺氧或生物活性分子条件下体外培养MSCs，通过基因工程方法增强细胞保护因子的MSC可以为改善归巢后MSC的有效性，笔者认为，虽然目前绝大多数实验均处在动物实验阶段，需要更多的临床实验，来验证其有效性。另外，其潜在风险同样值得重视，尤其是基因编辑后的潜在肿瘤风险增加，但在注射前提高MSC的质量，不失是MSC治疗的一种创新策略，值得进一步研究。

3　MSC应用于肾移植可能的相关机制

关于MSC的应用于肾移植的潜力来自于几种性质，包括其能够分化为各种细胞谱系的能力；分泌促进移植肾组织修复和增殖再生的可溶性因子，以及调节免疫应答的能力，目前研究大多认为MSC归巢到受损组织后其旁分泌效应对组织修复起到至关重要的作用，MSC与周围环境相互作用的关键涉及到其释放的数十种对局部细胞产生深远影响的活性生物因子，这些释放的因子可以防止周围细胞凋亡并刺激其增殖，从而促进损伤组织的再生。进一步的证据显示，输注的MSC一旦归巢到损伤的组织部位，与缺氧，炎性细胞因子，内毒素等互相作用，这些因素反过来刺激MSC分泌几种促进组织修复的相关因子，其中VEGF是较为重要的一种，VEGF是一种同源二聚体糖蛋白，它能增加微血管与小静脉血管的通透性。并促进血管内皮细胞的增殖，这些都与肾小管的再生有关。而肝细胞生长因子是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，其能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动以及促进肾小管形态发生，在组织器官损伤修复、形态发生过程中可发挥重要作用。FRANQUESA等［28］通过建立大鼠移植肾肾病模型，分为实验组合对照组；实验组注射MSC；发现与对照组相比，实验组的12及24周后的病理标本提示较少的间质纤维化和小管萎缩；他们认为MSC可以通过减少组织损伤的因素，减少移植肾纤维化。并且认为其机制主要为减轻炎症反应，增加抗炎因子的表达，而不是单纯的通过分化增殖替代受损组织。另外，有研究报道MSC可清除氧自由基，减少氧化应激降低器官损伤的严重程度。这一观点，即MSC释放的活性因子可以防止活性氧（ROS）的积累或增强清除活性，这种机制在体外实验中也已证明［29］。而ROS则是公认的引起细胞功能障碍和凋亡的因素之一。

除了旁分泌机制，MSC应用于肾移植另一个不可忽视的作用，就是其免疫调节作用。正如之前所述，间充质干细胞具有低免疫原性，不表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类或共刺激分子。体外和体内研究都报道了MSC与广泛的免疫细胞相互作用，并显示出抑制T细胞，B细胞，树突状细胞，巨噬细胞和自然杀伤细胞过度反应的能力［30］；调节性T细胞（Treg）是一种具有免疫抑制活性的CD4+T细胞亚群，它们可以通过细胞⁃细胞直接接触及分泌细胞因子抑制效应T细胞的增殖。已经发现，MSC可促进体内Treg的增殖和活化［31］。并保持Tregs抑制自身反应性效应T细胞反应的能力。MSC还可以抑制Th1的功能，而Th1刺激IFN⁃γ的产生是移植肾体液性排斥发生机制的重要通路之一。然而，对于上述观点，科学界仍有争论，最近的研究认为，MSC的免疫调节性质不仅仅是负调节免疫系统，更具体地，MSC的免疫特性主要与所处环境有关，在炎症环境中其可负调节免疫应答，减轻炎症水平，在炎性因子水平过低时则释放促炎因子刺激免疫系统。

公民身后捐献已成为我国肾移植的首要供肾来源，但其缺血时间长，排斥和功能恢复延迟（DGF）发生率高，目前大多研究表明MSC具有旁分泌各种活性因子帮助组织修复、抗纤维化以及免疫调节功能，正基于此，研究者们认为其可应用于减少移植术后排斥反应的发生以及DGF发生率，减少机会性感染风险。MSC的这些特性，为改善肾功能、提高移植肾长期存活率提供了新的思路。

4　展望

最近的研究结果似乎均表明了MSC输注具有良好的安全性和耐受性，有着广阔的应用前景，但在MSC可以大规模应用于临床前，仍有许多工作要做。供体异质性，离体扩增，免疫原性和冷冻保存等问题亟待解决，自体干细胞移植和异体干细胞移植之争仍然存在，自体MSC无伦理学问题，可减少感染及可能存在的潜在排斥反应风险，但需预先制备，时效性较差；异体MSC具有良好的时效性，与现有的异体输注血制品类似，在应用前可经过严格的筛查和检测以保证其安全性和MSC活性，更加适合临床使用，但其潜在感染和肿瘤发生可能同样值得关注，而MSC与常规免疫抑制药物的联用也是研究的重要方向，科学家们正在研究MSC联用现有常用免疫抑制药物，评估其安全性并探索可行治疗方案，旨在减少常规免疫抑制药物的用量而达到接近耐受甚至免疫耐受状态，从而减少甚至消除药物的肾毒性。到目前为止，MSC应用于肾移植患者其短期疗效及安全性，可行性值得肯定，但其对移植物长期存活率以及潜在风险仍需进一步大规模临床实验进一步探索。预处理或遗传修饰可能会增强MSC的能力［32-33］。这也提示，增强的MSC可能成为现有治疗领域的重要工具，通过增强MSC的能力，从而扩宽边缘供肾的使用标准，降低器官弃用率。

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