周祉妤，昌建鈞，候亚鹏，丁炎，聂宏光

(中国医科大学，沈阳110122)

间充质干细胞(MSCs)是一种非造血成体干细胞，具有多向分化和自我更新能力[1]。研究发现，MSCs能够减轻肺组织损伤并促进其修复，可用于急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘和肺纤维化等肺部疾病治疗[2～5]。有研究表明，MSCs所分泌的因子是其发挥组织修复作用的关键[6～8]。骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSCs-CM)是用于MSCs培养的无血清培养基，其内含有MSC分泌的各种因子。2016年9月～2017年10月我们进行本研究，旨在探讨BMSCs-CM对小鼠肺泡上皮细胞增殖的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性C57小鼠，SPF级，3周龄，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证：SCXK(辽)2015-0001。肺泡Ⅱ型细胞(ATⅡ细胞)、人肺泡上皮细胞A549(上海复祥生物科技有限公司)；DMEM/F12、RPMI 1640、FBS(HyClone)，胰酶(Cellgro)，重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech)，FITC标记的CD34、APC标记的CD44(BD Pharmingen)，小鼠抗钠通道蛋白α(α-ENaC)单克隆抗体(Abcam)，小鼠抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruz)；RT-PCR 试剂盒(Qiagen)。

1.2 BMSCs分离、鉴定及BMSCs-CM获取 将C57小鼠处死后用酒精浸泡消毒，暴露双后肢肌肉，在膝关节处剪断，取股骨，置于预冷的PBS中，剥离肌肉和筋膜，将剔除干净的股骨放入预冷的PBS中。用2 mL含10% FBS、1%青霉素/链霉素及重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子(10 ng/mL)的DMEM/F12培养基冲洗股骨骨髓腔，直至冲洗干净，即股骨发白，获得骨髓细胞。将细胞置于37 ℃、5% CO2和95% O2条件下培养。24 h后更换培养液，隔日换液1次，待细胞融合70%～80%时传代。

1.2.1 BMSCs培养及鉴定 选择第2代生长状态良好的细胞，37 ℃、0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，移入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清；加入预冷的PBS，再次吹打混匀成细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。细胞计数板计数，根据计数结果用PBS适当调整悬液体积，使细胞密度为(1～10)×106个/mL。取300 μL细胞悬液置于装有10 μL相应抗体、FITC标记的CD34及APC标记的CD44的EP管中，流式细胞仪检测。结果显示，分离培养的细胞CD44阳性表达率为92.5%，CD34阴性表达率为97.3%，提示分离培养的细胞为BMSCs，且其纯度较高。

1.2.2 BMSCs-CM获取 当第2代细胞生长融合70%～80%时，PBS清洗2～3次，加入无血清的DMEM/F12培养基，培养24 h收集其培养基即为BMSCs-CM。将BMSCs-CM用0.22 μm滤器过滤后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 BMSCs和BMSCs-CM对A549细胞存活率的影响 将人肺泡上皮细胞A549体外常规培养，取生长状态良好的对数生长期细胞按1.6×105个/孔接种于24孔板中，孔中加入10% FBS、1%青/链霉素的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2、95% O2培养箱中培养12 h，吸去培养基，PBS清洗，加入无血清培养基饥饿处理12 h。加入含10% CCK-8的培养基，避光孵育1 h。PBS清洗3次，将24孔板中的细胞随机分为对照组、无血清组、BMSCs组、BMSCs-CM组，每组设3个复孔。其中，对照组以含10%血清的DMEM/F12培养基培养，无血清组以无血清的DMEM/F12培养基培养，BMSCs组加入已接种小鼠BMSCs的Transwell(细胞密度为8×104个/孔)用无血清的DMEM/F12培养基共培养，BMSCs-CM组以获取的小鼠BMSCs-CM培养。以常规培养细胞为空白对照。培养24 h后吸去各组培养基，加入含10% CCK-8的RPMI 1640培养基，检测各组光密度(OD)值，计算细胞相对存活率。细胞存活率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。相对存活率=实验组存活率/对照组存活率。

1.4 BMSCs-CM对ATⅡ细胞α-ENaC表达的影响 采用Real-time PCR法。体外常规培养ATⅡ细胞，用含10% FBS和1%青/链霉素的DMEM/F12培养基培养，待其生长融合70%～80%时，将细胞随机分为DMEM/F12组、BMSCs-CM组，每组设4个复孔(1.6×105个/孔)。其中，DMEM/F12组以无血清的DMEM/F12培养基培养24 h，BMSCs-CM组以获取的小鼠BMSCs-CM培养24 h。PBS清洗3次，用TRIzol试剂提取总RNA，检测RNA浓度。取5 μg总RNA通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析其纯度。取1 000 ng总RNA进行逆转录，逆转录产物应用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行实时荧光定量PCR反应。反应条件：预变性95 ℃、30 s，单循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环。α-ENaC引物：上游引物5′-AACAAATCGGACTGCTTCTAC-3′，下游引物5′-AGCCACCATCATCCATAAA-3′，产物大小为406 bp。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算α-ENaC相对表达量。

2 结果

2.1 BMSCs和BMSCs-CM对A549细胞存活率的影响 无血清组细胞相对存活率为(80.70±0.70)%，BMSCs组为(85.83±1.98)%，BMSCs-CM组为(91.28±1.91)%，BMSCs组与BMSCs-CM组细胞相对存活率均高于无血清组(P<0.05或<0.01)，BMSCs组与BMSCs-CM组比较P>0.05。

2.2 BMSCs-CM对ATⅡ细胞α-ENaC表达的影响 DMEM/F12组α-ENaC相对表达量为1.00±0.00，BMSCs-CM组为3.16±1.50，两组比较P<0.05。

3 讨论

MSCs是一种非造血成体干细胞，具有多向分化和自我更新能力，广泛存在于骨髓、脐带、脐血、外周血、脂肪等组织中[1]，可用于修复或替代受损和病变的多种组织器官[9,10]。研究发现，MSCs的旁分泌效应(即将相关因子分泌到培养基)具有抗炎、抗菌和调节肺通透性的作用，其作用机制主要涉及增加抗炎介质、减少促炎性因子分泌的免疫调节效应、分泌生长因子的屏障修复效应、肺泡液体清除效应以及肺泡上皮细胞凋亡的抑制效应等[11～14]。 BMSCs-CM是MSCs在无血清培养基培养24 h后收集其培养基所获得的条件培养基，它含有MSCs分泌的各种因子。由于MSCs旁分泌对肺泡上皮细胞Na+运输有一定的调节作用，并且能够恢复顶侧膜对Na+的运输，因此我们推测其对ENaC亦有一定的调控作用。随着干细胞科学与医学技术的发展，MSCs旁分泌效应的应用范围逐渐扩大，近年来已经成为基础医学和临床医学组织器官损伤修复以及再生领域研究的热点。

急性肺损伤是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的肺部炎性反应，其肺泡毛细血管上皮细胞及肺部屏障结构受损，肺气体交换功能发生障碍，是一种以急性、进行性、顽固性低氧血症为特征的临床综合征，是目前导致危重患者死亡的主要原因[15]。急性肺损伤的临床特征之一是严重肺水肿，肺泡内液体清除与肺水肿密切相关，增强肺泡内液体清除即加速肺泡内积聚液体的清除，有助于减轻肺水肿病情[16]。肺泡内的液体由肺泡上皮的ENaC、水通道蛋白和钠钾腺苷三磷酸酶进行清除[1,9,15]。其中ENaC是其最主要的方式。ENaC最初是由Canessa等[17]从鼠结肠上皮细胞中克隆出来的。随着研究的不断深入，人们在肾脏、结肠、肺脏、大脑、卵巢、睾丸和胰腺等组织相继发现了ENaC表达[17～19]。人体中的ENaC由四种亚基组成，分别为α、β、γ和δ，其生理功能是跨越紧密连接上皮单向转运钠离子，调节水和离子的转运[20]。ENaC表达降低将导致肺水肿形成，因此调控ENaC对急性肺损伤患者的肺水肿清除至关重要[21]。

本研究通过CCK-8细胞增殖实验验证了BMSCs与肺泡上皮细胞共培养以及BMSCs-CM均能使肺泡上皮细胞的生存能力增强，由此推测BMSCs及其条件培养基可能通过提高肺泡上皮细胞的生存能力从而介导对急性肺损伤的治疗作用，同时也验证了MSCs的旁分泌效应对细胞增殖发挥了重要作用。由于BMSCs-CM中含有MSCs分泌的各种因子，因此我们推测其分泌的一些特异性生长因子可能参与其中，具体机制有待于进一步研究。

ENaC表达变化对于急性肺损伤的发生、发展极其重要，α亚基是ENaC主要的功能亚单位。本研究结果显示BMSCs-CM能够使α-ENaC表达升高，证明BMSCs-CM对肺泡上皮细胞有保护作用。由此推测，BMSCs-CM可通过调控α-ENaC表达进而调节肺泡液体清除率，可对水肿型急性肺损伤起到一定的治疗作用。

综上所述，BMSCs-CM可促进肺泡上皮细胞增殖，其机制可能与促进肺泡Ⅱ型细胞α-ENaC表达有关。

参考文献：

[1] Ware LB,Matthay MA. Alveolar fluid clearance is impaired in the majority of patients with acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respir Crit Care Med,2001,163(15):1376-1383.

[2] Ortiz LA,Dutreil M,Fattman C,et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung Injury[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(26):11002-11007.

[3] Danchuk S,Ylostalo JH,Hossain F,et al. Human multipotent stromal cells attenuate lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via secretion of tumor necrosis factor-α-induced protein 6[J]. Stem Cell Res Ther,2011,2(3):27.

[4] Guan XJ,Song L,Han FF,et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF-VEGF receptors[J]. J Cell Biochem,2013,114(2):323-335.

[5] Wang H,Yang YF,Zhao L,et al. Hepatocyte growth factor gene-modified mesenchymal stem cells reduce radiation-induced lung injury[J]. Hum Gene Ther,2013,24(3):343-353.

[6] Helena KS. Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome[J]. Biochimie,2013,95(12):2196-2211.

[7] Goolaerts A,Pellan-Randrianarison N,Larghero J,et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,306(11):L975-L985.

[8] Downs CA,Trac DQ,Kreiner LH,et al. Ethanol alters alveolar fluid balance via nadph oxidase (NOX) signaling to epithelial sodium channels (ENaC) in the lung[J]. PLoS One,2013,8(1):e54750.

[9] Berthiaume Y,Matthay MA. Alveolar edema fluid clearance and acute lung injury[J]. Respir Physiol Neurobiol,2007,159(3):350-359.

[10] Williams AR,Hare JM. Mesenchymal stem cells: biology,pathophysiology,translational findings,and therapeutic implications for cardiac disease[J]. Circ Res,2011,109(8):923-940.

[11] Lee JW,Fang X,Krasnodembskaya A,et al. Concise review: mesenchymal stem cells for acute lung injury: role of paracrine soluble factors[J]. Stem Cells,2011,29(6):913-919.

[12] Krasnodembskaya A,Song Y,Fang X,et al. Antibacterial effect of human mesenchymal stem cells is mediated in part from secretion of the antimicrobial peptide LL-37[J]. Stem Cells,2010,28(12):2229-2238.

[13] Fang X,Neyrinck AP,Matthay MA,et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells restore epithelial protein permeability in cultured human alveolar type Ⅱ cells by secretion of angiopoietin-1[J]. J Biol Chem,2010,285(34):26211-26222.

[14] Lee JW,Krasnodembskaya A,Mckenna DH,et al. Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells in ex vivo human lungs injured with live bacteria[J]. Am J Respir Crit Care Med,2013,187(7):751-760.

[15] Jiang L,Fei D,Gong R,et al. CORM-2 inhibits TXNIP/NLRP3 inflammasome pathway in LPS-induced acute lung injury[J]. Inflamm Res,2016,65(11):905-915.

[16] Deng J,Wang D,Liang A,et al. Effects of baicalin on alveolar fluid clearance and α-ENaC expression in rats with LPS-induced acute lung injury[J]. Can J Physiol Pharmacol,2017,95(2):122-128.

[17] Canessa CM,Schild L,Buell G,et al. Amiloride-sensitive epithelial Na+channel is made of three homologous subunits[J]. Nature,1994,367(6462):463-467.

[18] Kashlan OB,Kleyman TR. Epithelial Na(+) channel regulation by cytoplasmic and extracellular factors[J]. Exp Cell Res,2012,318(9):1011-1019.

[19] Thibodeau PH,Butterworth MB. Proteases,cystic fibrosis and the epithelial sodium channel (ENaC)[J]. Cell Tissue Res,2013,351(2):309-323.

[20] Qadri YJ,Rooj AK,Fuller CM. ENaCs and ASICs as therapeutic targets[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2012,302(7):C943-C965.

[21] Althaus M,Clauss WG,Fronius M. Amiloride-sensitive sodium channels and pulmonary edema[J]. Pulm Med,2011,2011:830320.