苗栓林,曹晓朋,胡丽芳

非小细胞肺癌是我国最常见、病死率最高的恶性肿瘤,其主要类型包括腺癌、鳞癌等小细胞肺癌，约占全部肺癌的80%[1]。由于非小细胞肺癌早期临床特征不明显，其检出率和诊断率低下，患者确诊时多为中晚期并伴转移，其中肺癌骨转移是其最常见的转移类型之一，可导致常规手术治疗、放化疗效果欠佳，严重威胁患者的生命安全[2]。由于肺癌骨转移患者自身条件普遍较差，故放化疗治疗相对受限[3]。细胞免疫治疗作为新型治疗技术，对多种恶性肿瘤疗效满意，本研究选择自体细胞免疫治疗(cytokine-induced killer, CIK)联合序贯放化疗治疗肺癌骨转移，探讨其应用效果与病理组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变状态的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2015年1月—2017年2月延安大学咸阳医院收治的肺癌骨转移91例，男51例，女40例；年龄(48.3±11.6)岁；病程(3.72±1.65)年；病理类型：腺癌48例，小细胞肺癌30例，鳞癌13例；转移情况：肋骨转移32例，胸椎转移28例，腰椎转移25例，骨盆转移6例。纳入标准：①根据临床表现和肺癌组织病理活检确诊肺癌，同位素全身骨扫描确诊肺癌骨转移；②符合CIK治疗、序贯化放疗适应证；③患者和家属均具备独立行事能力，了解治疗风险，愿意配合治疗研究。排除标准：①存在骨结核、骨折、骨恶性肿瘤等疾病；②存在精神心理疾病，难以配合治疗。本研究已获医院伦理委员会批准。

1.2治疗及检测方法

1.2.1序贯放化疗治疗方法：全部病例评估治疗潜在风险、相关治疗适应证，给予序贯放化疗治疗，即NP化疗方案：酒石酸长春瑞滨注射液(江苏豪森药业股份有限公司，国药准字：H20031337)30 mg/m2静脉注射，第1 d、第8 d；注射用顺铂(山东凤凰制药股份有限公司，国药准字：H20056422)40mg静脉滴注，第1～3 d。4周为1个疗程，连续化疗3个疗程。化疗结束后，应用放疗直线加速器(美国瓦里安公司生产)于化疗第1 d给予放疗，2 Gy/d，每周放疗5次。每周10 Gy，总剂量为60 Gy。

1.2.2自体CIK细胞免疫治疗方法：化疗第1 d同时给予自体CIK细胞免疫治疗，常规采集外周静脉血100 ml，差速离心分离单个核细胞。放入无血清培养基并于37℃孵箱中培养2 h，PBS去除未贴壁细胞，继续培养并加入购自齐鲁制药有限公司(国药准字：201612086LAB)的注射用重组人白细胞介素-11注射液(rhIL-11)和购自厦门特宝生物工程股份有限公司(国药准字：20141127、20160609)的注射用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)诱导单个核细胞CIK方向分化，加入白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子诱导CIK成熟，经形态学和分子生物标志物鉴定后持续扩大培养，回输至患者体内，隔日1次，共4次。

1.2.3免疫组化检测EGFR基因突变情况：CT引导穿刺获得肺癌组织，乙醇梯度脱水、包埋后石蜡切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，去除内源性过氧化物酶，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高温高压修复并冷却至室温，羊血清封闭后滴加EGFR抗del19和mut21突变抗体(Abcam Technology, Cambridge, UK)，稀释比例1∶100，4℃孵育过夜；次日依次给予链霉素标记的羊抗兔二抗孵育15 min，链霉素标记的抗生物素孵育10 min，显微镜下DAB显色1～3 min，流水冲洗10 min，苏木素复染细胞核2 min，流水再次冲洗10 min返蓝，最终经乙醇梯度脱水和二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜下评估EGFR突变情况。免疫组化二抗试剂盒及DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.4基因测序法检测EGFR基因突变情况：在用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)方法检测同时，采用基因测序法检测EGFR基因突变情况。肺癌组织标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋后切片，直接采用基因测序法检测EGFR基因是否存在基因缺失、突变情况，初次检测结果采用引物再次进行反向测序验证。基因分析仪型号为ABI 3710Genetic Analyzer(美国Applied Biosystems公司)。EGFR测序法检测相关突变的引物序列如下:del19上游引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3'，下游引物5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；mut21上游引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，下游引物:5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。

1.3观察指标及方法

1.3.1疗效判定：根据中国肺癌骨转移诊疗专家共识(2014版)[4]评估自体CIK细胞免疫治疗联合序贯化疗的效果，即治疗后3个月观察患者症状改善程度，癌灶大小变化。治疗有效评价标准为：癌症所致疼痛、呼吸困难等症状缓解甚至消失，肺癌及转移灶缩小，无明显不良反应和并发症。

1.3.2EGFR基因突变评价标准：EGFR基因突变免疫组化检测的阳性评价标准为细胞内出现棕黄色颗粒，评分包括阳性细胞比例评分和显色强度评分两项，二者之积即为该组织EGFR表达评分。每一份标本均由两名病理科医师经盲法评估，取平均值作为表达水平进行评分。①阳性细胞评分：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。②染色强度评分：阴性0分；弱阳性1分；中等2分；强阳性3分。评分≤7分视为阴性，评分≥8分视为阳性[5]。

2 结果

2.1临床疗效 91例肺癌骨转移经治疗后有效者70例，有效率达76.92%。

2.2免疫组化检测结果 EGFR基因突变阳性为细胞内出现棕黄色颗粒。见图1。治疗有效组EGFR基因的del19和mut21突变检测评分和阳性率均明显高于治疗无效组 (P<0.05)。见表1。

表1 两组表皮生长因子受体基因突变差异评分和突变阳性率比较

2.3基因测序检测结果 治疗有效组EGFR基因的del19和mut21突变检出率均明显高于治疗无效组 (P<0.05)。见表2。

表2 两组表皮生长因子受体基因突变阳性率比较[例(%)]

图1两组免疫组化检测表皮生长因子受体基因突变(SP×200)

A.有效组del19检测结果;B.有效组mut21检测结果;C.无效组del19检测结果;D.无效组mut21检测结果

3 讨论

免疫治疗是近年继手术、放疗、化疗之后第4种具有治愈恶性肿瘤疾病希望的治疗技术。因肿瘤细胞存在较强的免疫逃逸和免疫抑制功能，可有效摆脱正常免疫细胞的杀伤效应[6]。因此，通过诱导和增强机体对肿瘤细胞的免疫力，经免疫系统特异性杀伤肿瘤细胞，成为控制肿瘤生长，最终实现恶性肿瘤治愈[7]的新技术。目前，免疫治疗常用的方法主要包括免疫细胞治疗、免疫检查点特征性抑制剂、针对性抗体、溶瘤病毒、特异性癌症疫苗，其他免疫系统调节剂等，被应用于不同肿瘤的基础研究和临床试验性治疗，取得了一定的疗效[8]。

近年来，大量恶性肿瘤的免疫治疗研究发展迅速，亦成为晚期非小细胞肺癌临床治疗的热点[9]。本研究基于肺癌发病、发展的特点和原理，选择自体CIK细胞免疫治疗。CIK细胞是主要组织相容性复合物不受限的T淋巴免疫细胞，其分子表现为CD3+CD56+T阳性，具有极快的增殖和复制能力、广谱抗瘤性和强杀瘤活性[10]。人外周血单个核细胞经科学培养、针对性诱导分化成熟CIK细胞，重新回输至患者体内，可提高肿瘤细胞识别能力，并通过释放大量分子靶向毒性颗粒作用于肿瘤细胞膜，裂解肿瘤细胞导致其死亡[11]。此外，与其他自体治疗技术一致，具有免疫排斥发生率低、治疗相对安全的优势[12]。

骨转移是肺癌最常见的转移部位之一，以肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等多见，可致患者骨骼疼痛、功能瘫痪甚至死亡。针对肺癌骨转移，常规放化疗可大规模的杀灭和抑制肺癌细胞，但残留肿瘤细胞成为日后复发、转移的重要根源或唯一根源，也是手术、放化疗治疗失败的根本原因[13-15]。故辅以CIK细胞免疫治疗，可在细胞水平针对残留的肺癌细胞继续杀灭并抑制肺癌，极大地降低了复发率、转移率，延长生存时间，并有效提高其生存质量[16-17]。本研究对全部肺癌骨转移给予自体CIK细胞免疫治疗联合序贯放化疗，有效70例，有效率达76.92%，证实该治疗临床效果确切。

EGFR是ErbB家族的一种跨膜糖蛋白，作为细胞增殖和信号传导受体，可刺激细胞生长失控、持续生长，最终发生癌变和远处转移，如骨转移、脑转移等[18-19]。目前，大量研究发现EGFR 基因突变状态是筛选非小细胞肺癌患者进行酪氨酸激酶抑制剂( TKI) 治疗最有价值的指标[20-23]。同时，检测 19 外显子 E746-A750 缺失和 21 外显子 L858R 点突变的 EGFR 基因突变特异性抗体已成为准确、快速和经济的 EGFR 基因突变筛查方法用。本研究分别采用免疫组化和qPCR法检测肺癌组织中EGFR基因突变情况，发现自体CIK细胞免疫治疗联合序贯放化疗治疗有效组EGFR基因突变检出率显著高于无效组，即del19和mut21检出率均显著高于无效组，提示EGFR基因突变的肺癌骨转移，给予该方法治疗具有更好的疗效。

综上所述，肺癌骨转移进行自体CIK细胞免疫联合序贯放化疗，疗效满意，且EGFR组织基因突变状态应用该方法疗效更好。

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