张金玲，杜祎，高广恒，赵晓华，张利群，朱思荣，史建国，毕春元

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌属的黄曲霉、特曲霉和寄生曲霉等产生的一类代谢产物，主要存在于霉变的玉米、花生中，天然污染产生的黄曲霉毒素以AFB1最为多见[1-3]。因AFB1具有极强的毒性和致癌性，国家标准GB 2761—2011[4]对玉米中黄曲霉毒素B1的限量指标规定为20 μg/kg以内。因此，研究食品中黄曲霉毒素的检测方法具有重要意义。

目前，黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层层析法、免疫亲和柱荧光光度法、高效液相色谱法及酶联免疫吸附法等[5-12]。高效液相色谱法测定结果准确，但是使用仪器昂贵，测定成本高；上述其他三种方法均不能对黄曲霉毒素B1进行专一性测定，且人为操作对结果的影响较大，准确率低。本研究采用醋酸纤维素载体膜制备固定化黄曲霉氧化酶酶膜，建立了流动注射酶电极生物传感器分析方法，对玉米中黄曲霉毒素B1进行测定，结果表明，该方法具有专一性好、准确度高、测定成本低等特点。

1 实验材料与仪器

SBA-黄曲霉毒素B1生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)；玉米(高密某村购买),黄曲霉毒素氧化酶(山东省科学院生物研究所)；黄曲霉毒素B1标准品(Sigma公司)；牛血清白蛋白、戊二醛(上海化学试剂采购供应站进口分装)；“O”型空圈、SBA专用缓冲液(山东省科学院生物研究所)；醋酸纤维膜(孔径0.2 mm，美国Nucleopore公司)；铂金电极(山东省科学院生物研究所)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；其他试剂均为分析纯。所用水为蒸馏水。

2 实验方法

2.1 黄曲霉毒素氧化酶电极的制备

首先将“O”型空圈与醋酸纤维膜粘在一起做成载体膜，然后将黄曲霉毒素氧化酶与戊二醛交联，固定化于载体膜上，获得黄曲霉毒素氧化酶酶膜，进一步将其安装在铂金电极上获得黄曲霉毒素氧化酶电极。

2.2 反应原理

将黄曲霉毒素氧化酶与H2O2电极组成电流型电化学酶电极。当含有黄曲霉毒素的样品经流动注射系统流经该电极时，会在电极上发生如下反应：

过氧化氢在电极上产生电流：

此电流大小与黄曲霉毒素的浓度呈现良好的线性关系。

2.3 溶液的配制

2.3.1 黄曲霉毒素B1标准液的配制

取适量黄曲霉毒素B1标准品放入称量瓶中，于104 ℃烘箱内烘4 h，然后在干燥器内冷却；准确称取0.100 0 mg黄曲霉毒素B1标准品，用蒸馏水在100 mL烧杯中溶解，并全部转移至1 000 mL容量瓶，定容备用。

2.3.2 黄曲霉毒素B1待测样品溶液的配制

取待测玉米样品适量，打碎，过20目筛。准确称取20.0 g处理后玉米样品于250 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醛水溶液100 mL，将瓶塞盖紧，水封，震荡10 min，超声波萃取15 min，2 000 r/min离心5 min，取20 mL上清液备用。

2.4 黄曲霉毒素样品的测定

2.4.1 仪器定标

选择具有流动注射功能的SBA-黄曲霉毒素B1生物传感分析仪，在反应池内安装黄曲霉毒素B1氧化酶电极，缓冲液为0.2 mol/L、pH=7.2的磷酸盐溶液。接通电源后运行仪器，系统自动清洗反应池，随后自动进行定标、测定操作。通过控制机械手吸取2.3.1所配制黄曲霉毒素B1标准液对仪器进行定标，采用差分计数法，当溶液流经反应池时开始计时，4 s为一个计时周期，计时结束后仪器自动记录酶电极对标准液的响应值；重复该过程直到仪器提示定标通过。

2.4.2 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的稳定性

在SBA-黄曲霉毒素B1生物传感分析仪的样品盘内，放入10只盛有2.3.1所配制黄曲霉毒素B1标准液的样品管进行测试，计算酶电极对黄曲霉毒素B1测定的精密度。

2.4.3 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的线性性

参照2.3.1的方法，分别准确配制浓度为20、40、60、80、100 μg/L的黄曲霉毒素B1标准液，依次放入SBA-黄曲霉毒素生物传感分析仪样品盘1～5样品管位测试，观察仪器对黄曲霉毒素B1测定的线性情况。

2.4.4 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的加标回收率

参照2.3.2的方法配制玉米样品待测溶液，在SBA-黄曲霉毒素生物传感分析仪样品盘1～5位样品管内分别加入500 mL待测样品，然后依次加入500 mL浓度为20、40、60、80、100 μg/L的黄曲霉毒素B1标准液测试，观察仪器对黄曲霉毒素B1测定的加标回收情况。

2.4.5 酶电极法对玉米中黄曲霉毒素B1的检测

根据2.3.2的方法制备玉米待测样品，放入样品盘1～3位，用2.3.1所配制的黄曲霉毒素B1标准液对SBA-黄曲霉毒素B1生物传感分析仪进行定标，记录测定结果。

2.4.6 高效液相色谱法对玉米中黄曲霉毒素B1的检测

3 结果与分析

3.1 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的稳定性

在SBA-黄曲霉毒素生物传感分析仪的反应池内安装黄曲霉毒素氧化酶电极，缓冲液为0.2 mol/L、pH=7.2的磷酸盐溶液。接通电源后运行仪器并定标，在样品盘内放入10只盛有2.3.1所配制的黄曲霉毒素B1标准液的样品管进行测试，酶电极对黄曲霉毒素的测定结果见表1。

表1 黄曲霉毒素B1氧化酶电极对黄曲霉毒素B1的测定结果Table 1 Determination of aflatoxin B1 by aflatoxin B1 oxidase electrode

由表1可见，黄曲霉毒素氧化酶电极对黄曲霉毒素B1具有很好的稳定性，精密度为1.20%。

3.2 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的线性性

参照2.3.1的方法分别准确配制浓度为20、40、60、80、100 μg/L的黄曲霉毒素B1标准液，依次放入SBA-黄曲霉毒素生物传感分析仪样品盘1～5样品管位测试，酶电极对黄曲霉毒素B1的测定结果见图1。

图1 黄曲霉毒素氧化酶电极对黄曲霉毒素B1的响应Fig. 1 Response of aflatoxin oxidase electrode to aflatoxin B1

由图1可见，黄曲霉毒素氧化酶电极对黄曲霉毒素B1的响应在0 ～100 μg/L呈现很好的线性性，线性方程为y=1.008 9x-0.942 9，R2=0.999 6。

3.3 酶电极对黄曲霉毒素B1测定的加标回收率

参照2.3.2的方法配制玉米样品待测溶液，在SBA-黄曲霉毒素生物传感分析仪样品盘1～5位样品管内分别加入500 mL待测样品，然后依次加入500 mL浓度为20、40、60、80、100 μg/L的黄曲霉毒素B1标准液测试，酶电极对黄曲霉毒素的测定结果见表2。

表2 黄曲霉毒素B1氧化酶电极对黄曲霉毒素B1的测定结果Table 2 Experimental results of recovery rate of aflatoxin B1 by standard addition

由表2可见，黄曲霉毒素氧化酶电极对黄曲霉毒素B1的加标回收率为96%～102.4%。

3.4 酶电极法对玉米中黄曲霉毒素B1的检测

根据2.3.2的方法制备玉米待测样品，放入样品盘1～3位，用2.3.1所配制的黄曲霉毒素B1标准液对SBA-黄曲霉毒素B1生物传感分析仪进行定标，测定结果如表3所示。

表3 对玉米中黄曲霉毒素B1含量的测定结果Table 3 Determination of aflatoxin B1 content in corn

3.5 高效液相色谱法对玉米中黄曲霉毒素B1的检测

在2.4.6条件下测定2.4.5所测定的同一种玉米样品中黄曲霉毒素B1含量，测定结果如图2、3所示。

图2 高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1标准品图谱Fig.2 Determination of aflatoxin B1 standard by HPLC

图3 高效液相色谱法测定玉米样品中黄曲霉毒素B1的图谱Fig.3 Determination of aflatoxin B1 in corn by HPLC

由图2～3可以看出，高效液相色谱测定玉米样品中黄曲霉毒素B1含量为13.781 μg/L，比酶电极法测定结果高。酶电极法是对黄曲霉毒素B1进行专一性测定，而高效液相色谱法无法避免假阳性带来的影响，因此测定结果偏高。

4 结论

本文提供了一种采用酶电极法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的快速分析方法，该方法测试了线性、精密度和回收率等指标，分析方法线性良好，线性相关系数为0.999 6，精确度为1.20%，加标回收率在96%～102.4%之间。同时采用高效液相色谱法进行同种样品测定，实验结果表明，酶电极法可以避免假阳性对黄曲霉毒素B1测定结果的影响，适用于玉米中黄曲霉毒素B1的检测。

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