吴 忧，莫书荣，张 鑫（广西医科大学生理教研室，广西南宁530021）

肿瘤是一类常见且多发的疾病，是导致人类死亡的主要原因之一。根据我国恶性肿瘤发病和死亡分析，全国恶性肿瘤发病与死亡第1位均为肺癌[1]。据报告显示，我国2015年估计有4 292 000例癌症新发病例，2 814 000例癌症死亡，肺癌成为最常见癌症，也是癌症死亡的首要原因[2]。

肺癌按其组织学分型有以下2种基本类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中20%的肺癌患者属于SCLC，特点为肿瘤细胞倍增时间短，进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征；而另外80%的NSCLC患者中又被分成以下4种类型：鳞癌、腺癌、腺鳞癌和类癌，其中腺癌占肺癌的40%以上，女性多于男性，且易发生转移及血性胸腔积液。近20多年来肿瘤化疗发展迅速，应用越来越广泛。通过临床实践，化疗对SCLC的疗效无论是早期或晚期都较为肯定，甚至有根治的少数报告。化疗对NSCLC也有一定疗效，但仅为姑息，作用有待进一步提高。当前早期NSCLC的治疗主要是手术治疗，而中晚期肿瘤则以化疗为主。而化疗会抑制骨髓造血系统，主要是白细胞和血小板的下降，因此限制了其化疗药物的使用剂量[3]。

中药因其独特的抗肿瘤特性在全球范围内越来越引人关注，研究表明，中医治疗肺癌能减轻手术，放、化疗的不良反应，提高机体免疫力和患者生活质量[4-5]，而黄芪作为我国的传统中药便是其中之一。药理实验及临床报道表明，黄芪在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、糖尿病、延缓衰老等方面具有重要作用[6]。近年来通过对黄芪中的有效成分如黄芪多糖、黄芪甲苷的研究，临床对其抗肿瘤的作用及机制更加了解。本课题组通过使用黄芪注射液作为实验药物探究其对肺癌A549细胞的作用来寻找其适宜的作用浓度及时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 本科室冻存的人肺腺癌A549细胞系。

1.1.2 仪器与试剂 黄芪注射液（质量浓度为2000mg/mL，神威药业集团有限公司）；RPMI-1640（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；青霉素、链霉素（索莱宝科技有限公司）；活细胞计数试剂盒（CCK-8，同仁公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德生物工程有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；胰蛋白酶（北京博奥拓达科技有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2，北京索莱宝科技有限公司）；96孔板（Corning公司）；YJ.875型医用超净台（吴江市空气净化设备厂）；CO2培养箱（Thermo公司）；TD6M台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；移液枪（Eppendorf公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 0.25%胰蛋白酶溶液的配制 称取0.25 g胰蛋白酶粉剂和0.04 g EDTA-Na2同时溶于高压后放凉的100 mL PBS中，待完全溶解后用过滤器过滤溶液，密封放置4℃保存，使用时取出。

1.2.2 人肺腺癌A549细胞的培养 人肺癌A549细胞用RPMI-1640培养基配成的完全培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/L）培养，隔天换培养液，细胞长满单层细胞瓶后，用0.25%胰蛋白酶消化2 min后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用巴氏吸管吹下贴壁细胞后吸入离心管，以700 r/min离心5 min后取出弃上清，加入培养基重悬，再分至新细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2.3 倒置显微镜观察A549细胞形态 培养细胞并将其种于6孔板中，设对照组和不同质量浓度（100、200、400、600、800 mg/mL）的黄芪注射液组。在细胞生长贴壁约为孔板底部的80%时，加入不同质量浓度的黄芪注射液，培养24 h观察细胞形态，实验重复3次。

1.2.4 CCK-8法检测药物效应 取对数生长期A549细胞，调整浓度为2×104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100µL，同时设置空白调零孔，每组设置5个副孔，37℃、5%CO2培养箱培养过夜。第2天，用1.5 mL EP 管配制质量浓度分别为 100、200、400、600、800 mg/mL的黄芪注射液，每孔110µL替换原有的全部培养基，继续培养。分别培养24、48、72 h后每孔加入10µL CCK-8试剂继续混合培养1.5 h显色。酶标仪检测光密度（OD）值（检测波长为 450 nm），实验重复3次，汇总OD450值，计算抑制率，抑制率=[（对照组平均OD450值－实验组平均OD450值）/（对照组平均OD450值－空白组平均OD450值）]×100%。黄芪注射液的半数抑制浓度（IC50）采用改良寇氏法[7-8]：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，其中Xm：lg（最大剂量），I：lg（最大剂量/相临剂量），P：阳性反应率之和，Pm：最大阳性反应率，Pn：最小阳性反应率。

1.3 数据处理 采用Excel2010对数据进行汇总及初步处理，应用SPSS22.0统计软件对数据进行差异性分析，其所有数据以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。文中所用图采用GraphPad Prism 5软件制作。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察 对照组及100、200、400 mg/mL的黄芪注射液组细胞贴壁生长，形态呈上皮样，多角形，核仁明显，胞质饱满，边界清晰。在600 mg/mL黄芪注射液组中，可见部分细胞体积变小、形态变圆，皱缩，与邻近细胞分离，但仍有部分细胞贴壁生长；在800 mg/mL黄芪注射液组中，大部分细胞变圆且失去贴壁特性，呈现明显的细胞增殖抑制。见图1。

图1 各组A549细胞形态变化（20×）

2.2 黄芪注射液对A549细胞的作用 作用24 h时，100、200、400 mg/mL黄芪注射液组对细胞有促生长作用，但随着浓度的增加而减弱，600、800 mg/mL黄芪注射液组对细胞有抑制作用，且随浓度的增加而增强；作用48 h时，作用效果大致与24 h相同；而作用72 h后，400 mg/mL黄芪注射液组不再具有促细胞生长作用，600、800 mg/mL黄芪注射液组的抑制作用增强，见图2。作用 24、48 h 后，100、200、800 mg/mL 黄芪注射液组与对照组的OD450值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；作用 72 h 后，100、200、400、600、800 mg/mL 黄芪注射液组与对照组的OD450值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 黄芪注射液作用肺癌A549细胞的IC50计算 根据改良寇氏法计算 24、48、72 h 的 IC50分别为 776、851、616 mg/mL，作用48 h时，黄芪注射液对A549细胞有明显的促生长作用，而在72 h时，黄芪注射液对A549细胞的抑制作用明显增强。

图2 不同质量浓度黄芪注射液作用不同时间对A549细胞生长的作用

表1 各组作用不同时间A549细胞OD450值的比较（±s）

表1 各组作用不同时间A549细胞OD450值的比较（±s）

注：与对照组同时间比较，aP＜0.05；与同组72 h比较，bP＜0.05

组别对照组黄芪注射液质量浓度（mg/mL）100 200 400 600 800作用时间（h）24 0.342±0.023 48 0.342±0.023 72 0.664±0.063 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.389±0.034ab 0.369±0.025ab 0.352±0.033b 0.325±0.027b 0.290±0.027ab 0.835±0.074a 0.782±0.089a 0.551±0.057a 0.436±0.062a 0.378±0.041a

3 讨 论

肺癌是全世界目前恶性肿瘤死亡的首要原因，放、化疗方案因其确切的疗效一直是NSCLC临床治疗的首选，但其对人体血液系统有不良反应。在我国，中医药治疗恶性肿瘤历史悠久，并且中医药治疗肺癌有自己独特的理论体系和确切疗效，中西医学互为补充、相互交融的模式成为肺癌治疗发展的方向与趋势[9]，黄芪也因其抗肿瘤的特性备受关注。

本研究通过用黄芪注射液作用A549细胞观察其细胞形态的变化和增殖的影响，发现其在低浓度和短时间时对A549细胞有促生长的作用，加大浓度及延长作用时间能显著增强黄芪注射液对A549细胞的明显抑制作用。不同于黄芪单一活性成分的研究，如黄芪多糖[10]、黄芪甲苷[11]，均具有明显A549细胞抑制作用，而对细胞的促生长作用未在实验中发现。本研究结果显示，黄芪注射液在低浓度、短作用时间时对A549细胞具有促生长作用，其抑制作用在高浓度、长作用时间时显著。黄芪化学成分复杂，目前研究已经证实主要含有多糖、黄酮、皂苷及氨基酸等活性物质[12]。而肿瘤细胞自身不能合成氨基酸，所以其生长增殖所需皆需从外界获取。本实验中所用黄芪注射液中含有多种氨基酸，可能对肺癌A549细胞产生一定的促生长作用。

另就计算得出的黄芪注射液对肺癌A549细胞的IC50而言（计算得出作用细胞24、48、72 h的IC50分别为776、851、616 mg/mL），其浓度先升后降，初步可以得出，黄芪注射液作用A549细胞需要较高浓度及更长的作用时间才能达到较好的抑制效果。而如果需要得出更精确的、能适用于临床治疗的IC50仍需进一步进行细胞体内实验来探索验证。

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