申发燕，张海萍，钟山，白冬雨，张海芳，吴琴超

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，是由于黑色素细胞异常增殖而形成，结膜的恶性黑色素瘤临床较罕见，部分病例镜下观察缺乏黑色素，且病理形态多样，因此诊断较困难，本文回顾性整理分析3例结膜恶性黑色素瘤的临床及病理学特点，旨在提高对该疾病的认识水平。

材料与方法

1 材料

收集整理厦门大学附属第一医院病理科2012年1月～2018年5月诊治的具备完整资料的3例结膜恶性黑色素瘤，同期恶性黑色素瘤175例，因此结膜恶性黑色素瘤占同期黑色素瘤的1.7%。患者平均发病年龄65岁(范围54～83岁)，其中男性2例，女性1例。患者偶有眼红、异物感等临床症状，无视力下降,其中1例伴出血、渗出（表1）。

表1 3例结膜恶性黑色素瘤的临床资料Tab.1 Clinical data of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

2 方法

送检标本均用10%中性福尔马林液固定，经石蜡包埋，3µm厚组织蜡块切片，然后HE染色，显微镜下观察。免疫组织化学检测均用全自动多功能组织病理检测系统（Benchmark ULTRA）检测（美国VENTANA公司），本实验免疫组织化学检测方法是Multimer AP Red，显色系统为ultraVIEW Universal AP Red，一抗包括HMB-45、S-100、melan-A、cyclin D1、vimentin、CK、CD10、CD34、CD99、SMA、desmin、p53和Ki-67。以上一抗均购自福州迈新科技有限公司。步骤严格参照说明书进行，并设立已知的阳性对照及用PBS代替一抗的阴性对照，

结 果

1 大体检查

3例结膜恶性黑色素瘤患者均进行局部肿瘤切除术，切除标本范围均≤1cm，肿瘤大体呈结节状，其中肿瘤的最大径为0.7cm，浸润皮下最深距离为0.3cm，肿瘤切面界限不清,呈灰黑、灰褐或暗红色，质地中等。

2 镜下特点

病例1肿瘤细胞呈上皮样型，细胞呈腺泡样、巢团状排列，巢团间见毛细血管增生，瘤细胞呈卵圆形，胞质丰富、淡染，胞界不清，核稍大，核形不规则，部分胞核可见核沟，可见明显核仁，并见病理性核分裂像，伴较多量色素沉着。病例2肿瘤累及表面鳞状上皮，表皮伴破溃，见炎性纤维素性渗出，瘤细胞呈弥漫片状浸润性生长，瘤细胞呈梭形或长椭圆形，核大，核仁不明显，部分胞核呈泡状核，核分裂像多见，胞质透亮、淡染，可见核周空泡，胞界不清，可见少量色素沉着，并可见少量坏死。病例3肿瘤细胞部分区域呈巢团状的上皮样型排列，部分区域呈席纹状的梭形细胞排列，肿瘤累及表面鳞状上皮，上皮样型区域瘤细胞呈卵圆形，胞浆丰富、粉染，核大，核仁明显，伴核偏位；梭形细胞型区域，瘤细胞呈长梭形，胞浆粉染，胞界不清，核分裂像可见，间质较多量淋巴细胞为主炎细胞浸润，可见较多量色素沉着（表2，图1A-D）。

表2 3例结膜恶性黑色素瘤的病理资料Tab.2 Pathological data of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

3 免疫表型

肿瘤细胞含有黑色素，因此本研究采用ultra-VIEW Universal AP Red显色，阳性染色呈红色，有助于阳性细胞观察。免疫组织化学染色显示：3例 HMB45、melanA、S-100、cyclinD1和 vimentin均为阳性，2例为p53阳性，3例Ki-67增殖指数25%～60%。病例2瘤细胞为梭形细胞，并且色素不明显，为与其他间叶性肿瘤鉴别，加做CD10、CD99阳性，CK、CD34、SMA、Desmin均为阴性（表3及图1E-H）。

图1 结膜恶性黑色素瘤的HE染色及免疫组织化学染色。A，病例1肿瘤细胞呈上皮样型，细胞核大，核仁明显，并见黑色素沉着；B，病例2肿瘤细胞呈梭形细胞样型，可见出血、渗出；C，病例3上皮样区肿瘤细胞呈片状排列，核呈卵圆形；D，病例3梭形细胞区肿瘤细胞呈席纹状、旋涡状排列；E，HMB-45肿瘤细胞弥漫阳性表达；F，Melan-A肿瘤细胞弥漫阳性表达；G，S-100 肿瘤细胞弥漫强阳性表达；H，Cyclin-D1肿瘤细胞弥漫强阳性表达；比例尺，50µmFig.1 HE staining and immunohistochemistry of conjunctival malignant melanoma. A, case 1 tumor cells were epithelial-like type, with large nuclei,obvious nucleoli, and melanin deposition; B, case 2 tumor cells show spindle-cell morphology, with hemorrhages and exudates; C, epithelioid tumor cells of case 3,which are arranged in patches, with an ovoid vesicular nucleus; D, spindle tumor cells of case 3, which are arranged in whorled and storiform; E, diffuse positive expression of tumor cells for HMB-45; F, diffuse positive expression of tumor cells for Melan-A ; G, diffuse strong positive expression of tumor cells for S-100; H, diffuse strong positive expression of tumor cells for Cyclin-D1; scale bar, 50µm

4 分子检测结果

行BRAF V600E和c-Kit基因检测，其中1例检测出BRAF V600E基因突变，而未检测出c-Kit基因突变（表3）。

表3 3例结膜恶性黑色素瘤的免疫组织化学及基因检测结果Tab.3 Immunohistochemiscal and gene detection results of 3 cases of conjunctival malignant melanoma

5 随访

对该组3例患者通过电话随访，随访时间为术后3个月到5年，术后患者均未进行放化疗等相关治疗，现均未发现复发和转移。

讨 论

恶性黑色素瘤是高度恶性肿瘤，是由黑色素细胞异常增殖而形成，皮肤是恶性黑色素瘤的常见部位，也可以发生于乳腺、食管、直肠、肛门和口腔等多个部位，眼的恶性黑色素瘤常发生于葡萄膜、结膜、眼周皮肤和眼眶等部位，葡萄膜恶性黑色素以脉络膜最多见。结膜恶性黑色素瘤临床相对罕见，约占眼部恶性肿瘤的2%。有文献报道其发病率仅为千万分之四，球结膜、角膜缘结膜和睑结膜为相对好发部位[1,2]。

1 临床特点

患者发病年龄在各个年龄段均有出现，但随年龄增长发病率增高，以年龄较大者多见，60岁以上者占半数以上，而20岁以下者只占1%，男女差别不大，白种人较其他有色人种更易发病[3]。本组发病年龄为54岁、59岁和83岁，平均年龄65岁，本组男性患者多见（男2例，女1例）。结膜恶性黑色素瘤通常单侧发生、边界不规则、可见色素沉着，多数起自后天原发性的恶性黑色素瘤，少部分起自结膜色素痣，临床表现为结膜缓慢增大的肿块，初始约为小米粒大小，肿物处偶有眼红、异物感，无视力下降，部分肿物可出现出血、渗出。本组病例其中2例起自后天的原发性恶性黑色素瘤，病史2个月到1年；1例患者结膜有色素性病变数十年，近期出现肿物2月，且缓慢增大，并且双眼膜状物生长4年，进行性生长，平素常出现眼红、异物感。

2 病理特征

根据细胞形态特点，眼部的恶性黑色素瘤，可分为梭形细胞类型、上皮细胞类型和小细胞类型，其中梭形细胞类型预后最好，上皮细胞类型预后最差[4,5]。结膜的恶性黑色素瘤，一般体积较小，多小于1cm，大体一般为结节状生长，肿瘤富于血管，切面多呈棕褐或灰黑色，部分可伴有溃疡及渗出，肿瘤的界限一般不清楚。显微镜下观察，肿瘤细胞形态多样，部分呈束状排列的长梭形细胞，部分呈巢团状的上皮样细胞，部分呈小细胞型或混合型。肿瘤细胞呈上皮样型生长时，多排列呈巢团样、腺泡状或片状，瘤细胞较大伴多形性，胞质丰富、略嗜酸性，可见明显的大红核仁；肿瘤细胞呈梭形细胞型时，细胞的排列方式多为束状排列或席纹状排列，瘤细胞多呈长梭形或长椭圆形，细胞核多为空泡状核，一般不易见大红核仁，但可见多个小核仁；肿瘤细胞呈小细胞型时，瘤细胞呈弥漫片状分布或散在分布，细胞小，核深染，胞浆少，可呈裸核样，核仁不可见或仅见小核仁。以上各型均可见或不可见色素沉着，较易见核分裂像，可伴有坏死。本组研究病例以上皮样类型、梭形细胞类型或二者混合型为主要镜下形态。

3 免疫表型

恶性黑色素瘤通常以下免疫标志物可以弥漫阳性：HMB-45、melan A、S-100、vimentin、cyclin-D1和ki-67，其中HMB-45能特异性识别色素细胞和黑色素瘤细胞中的蛋白，可用于标记交界痣、蓝痣、恶性黑色素瘤等；melan A是T细胞识别的黑色素瘤抗原基因的产物，在上皮样恶性黑色素瘤中有较强的表达，在梭形细胞恶性黑色素瘤中表达会稍弱，同时在色素痣和色素细胞中也会表达；S-100蛋白也是黑色素细胞的标记物，常和HMB-45和melan A一起使用；vimentin在恶性黑色素瘤中通常也是阳性；cyclin-D1和ki-67主要用于良恶性黑色素肿瘤的鉴别，二者在恶性黑色素瘤中表达率均较高，且无随病变深度递减现象，ki-67增殖指数在恶性黑色素瘤中一般均大于10%。有些病例形态复杂，缺乏黑色素，为与其他肿瘤鉴别，可以加做CK，CD34，CD99，SMA，Desmin，Myogenin等指标；其中上皮性标记CK除了在癌中可以阳性外，在转移性的恶性黑色素瘤中也可以出现阳性表达，而它在恶性黑色素瘤中的原发部位为阴性。

4 分子检测

BRAF基因的单碱基突变是恶性黑色素瘤中最常检测到的基因变异，该基因也是靶向治疗的关键靶点，有学者报道我国恶性黑色素瘤BRAF基因的突变率约为25.5%,而其中大部分为BRAF(V600E)突变(89.1%)[6,7]，其他少见的突变位点还有V600K、V600R、V600D等[8]。国内有文献报道BRAF V600E和c-Kit的突变率均为7.7%，即在入组的13例病例中均发现各有1例发生V600E和c-Kit基因突变[9]。本组研究也检测到1例发生了BRAF V600E基因突变，而c-Kit基因未检测到突变。

5 鉴别诊断

发生于结膜的恶性黑色素瘤临床较少见，且形态学复杂多变，对于无色素的恶性黑色素瘤诊断更加困难。注意与以下疾病鉴别：①结膜色素痣：多发生于睑裂部的球结膜和角膜缘，是来源于神经外胚层的良性肿瘤，色素痣的表面光滑、色彩均匀呈黑色，无溃疡渗出，免疫组化ki-67增值指数一般＜10%。而恶性黑色素瘤患者年龄偏大，结节颜色不均一，边界不规则，可出现溃疡、渗出，有短期内生长较快的病史，免疫组织化学ki-67指数一般＞10%；p53和cyclin D1可出现弥漫强阳性表达，并且随病变加深，不出现递减现象；melan A在良性痣细胞和恶性黑色素瘤中均可表达，但是在恶性黑色素瘤中，melan A可以随着肿瘤厚度的增加、无瘤生存期的减少及死亡率的增加，而出现表达降低。②低分化鳞状细胞癌：鳞状细胞癌是结膜最常见的恶性肿瘤，它多发生于睑缘皮肤和结膜的交界区、睑裂区的角膜缘和内眦部泪阜等部位，紫外线过度照射是其重要的诱发因素，恶性黑色素瘤部分呈上皮样类型，与低分化鳞状细胞癌都可以出现明显核仁，特别对于无色素的上皮样类型恶性黑色素瘤，需要行免疫组织化学进行鉴别，低分化鳞状细胞癌P40、P63或CK5/6可呈一个或多个指标阳性，而HMB-45、melan A、S-100阴性。③分化差的肉瘤：恶性黑色素瘤形态多样，细胞可呈梭形或多角形，部分细胞胞质富粉染，胞核偏位，因此需与横纹肌肉瘤鉴别，横纹肌肉瘤肿瘤细胞myogenin、myogenin和MyoD1一般呈阳性表达，而S-100、melan A和HMB-45为阴性。有时瘤细胞呈束状排列，细胞呈梭形或雪茄样，需与平滑肌肉瘤鉴别，平滑肌肉瘤肿瘤细胞desmin和SMA呈阳性表达，而S-100、melan A和HMB-45为阴性。恶性黑色素瘤的肌源性标记均为阴性。

6 治疗及预后

结膜的恶性黑色素瘤患者5年生存率约为22%，预后与多种因素相关，包括肿瘤的解剖学部位、浸润的深度、累及的范围，另外还与肿瘤的细胞类型、肿瘤单发还是多发、是否有原发性获得性黑变病等有关；其中肿瘤的细胞类型中，梭形细胞类型预后较好，上皮样细胞类型预后较差；出现坏死时预后差；当肿瘤的浸润深度＞2 mm时，较易发生淋巴结转移，预后较差[10]；解剖学位于球结膜及角膜缘的恶性黑色素瘤预后较好，而位于睑结膜、穹隆部和泪阜的恶性黑色素瘤的预后较差，它可以侵袭眼球和眼眶，并且可以出现淋巴结和脑等其他部位的转移。

治疗上以手术切除为首选方法，推荐切除肿瘤边界外4mm处结膜，并切除肿瘤下方薄的巩膜瓣。病变仅累及结膜者，在彻底切除肿瘤后，在缺损区行羊膜移植术，如果肿瘤累及到角膜，需要彻底切除病灶，然后在角膜缺损区行板层角膜移植术。对于肿瘤累及范围较局限的患者，治疗成功的关键是进行早期肿瘤扩大切除术；而对于肿瘤累及范围较广的患者，可根据累及部位选择眼球摘除术或者眶内容物摘除术，受累淋巴结清扫术，冷冻、化疗及免疫治疗等多种治疗方式[11]。

目前，除了外科手术切除外，术后的靶向治疗效果也较显著，针对恶性黑色素瘤BRAF基因突变的靶向药物(vemurafenib等)，对患者有较好效果，与化疗相比能够显著延长无进展生存期和总生存期[12]。

发生于结膜的恶性黑色素瘤较难引起患者的早期注意，因为它对视力影响较小，导致患者缺乏早期就诊意识，掌握结膜恶性黑色素瘤的临床特征及病理学特点，提高患者的早期就诊意识，是提高患者预后生存的关键因素。