邵志华， 李瑛泽， 许 洁， 于金军， 刘志学， 李思光

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 南昌大学生命科学学院，南昌 330031； 3. 同济大学生命科学与技术学院，上海 200092)

Prominin1为5次跨膜的胆固醇结合糖蛋白[1-2]，定位于干细胞/肿瘤干细胞和光感受细胞等细胞膜上表面的凸起[3-6]。目前，Prominin1的配体和功能尚不清楚。研究发现，Prominin1的双等位基因突变或缺失导致视网膜变性，光感受细胞外节形成异常[7-12],因此，其可能在功能性质膜凸起的形成上发挥重要作用[7,13]。虽然有研究证明Prominin1在光感受细胞表达[9,11,14]，但对其在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)的表达鲜有报道。

Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+杂合鼠为Prominin1阳性细胞示踪小鼠，融合蛋白cre-ERT2在Prominin1启动子的驱动下表达。腹腔注射他莫昔芬后，cre-ERT2与他莫昔芬结合转入细胞核内，继而cre剪切杂合小鼠基因组ZsGreen上游的终止序列(stop序列)，促进绿色荧光蛋白ZsGreen的表达，即Prominin1阳性细胞及其后代可见绿色荧光。

本研究使用Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+转基因小鼠，结合免疫荧光和PCR技术，首次阐述了Prominin1在不同发育时期RPE的表达，丰富了Prominin1的组织表达谱，为视网膜的生长发育及疾病发生的研究提供了新的线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型C57BL/6小鼠(6～8周龄)购于上海普尔毕凯实验动物有限公司。转基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J(Prom1cre/ERT2+/-)和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J(Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+/+)购于Jackson实验室(The Jackson Laboratory)。

1.2 试剂和抗体

他莫昔芬(T5648)、玉米油(C8267)、NaOH(S5881)、蔗糖(V900116)、EDTA(EDS)、Tris-HCl(T1503)、Triton X-100(T9284)、Tween 20(P1379)和荧光抗衰减封片剂(10981)购自Sigma公司；无水乙醇(10009218)购自国药集团药业股份有限公司；PBS(SH30256)购自HyClone公司；TRIzol(15596-026)、驴抗小鼠(A-21209,1∶1000)、驴抗兔(A-11072,A-21206,均1∶1000)购自Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒(RR036A)和SYBR Premix Ex Taq II Mix(RR820A)购自TaKaRa公司;Rabbit anti-Otx2抗体(AB9566,1∶500)购自Millipore公司;Rat anti-Prominin1抗体(14-1331,1∶100)购自eBioscience公司;DAPI(10236276001,1∶1000)购自Roche公司;Donkey血清(017-000-121)购自Jakson公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PCR鉴定转基因小鼠 转基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J按雌雄2∶1比例进行合笼，获得F1代杂合小鼠。F1代杂合小鼠出生后20d剪取尾尖，碱裂解法提取DNA后进行PCR鉴定。碱裂解法采用NaOH(25mmol/L)和EDTA(0.2mmol/L)混合液，98℃裂解1h。裂解产物冷却至室温后用等量的Tris-HCl(40mmol/L,pH为8.8)中和后离心，上清液可用于后续的PCR反应。转基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J的PCR鉴定引物序列为Mutant1 F： 5′-CAGGCTGTTAGCTTGGGTTC-3′, Mutant1 R： 5′-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3′，产物长度为320bp；B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J的PCR鉴定引物序列为Mutant2 F： 5′-GGCATTAAAGCA-GCGTATCC-3′，Mutant2 R： 5′-AACCAGAAGTGG-CACCTGAC-3′，产物长度为199bp。PCR扩增反应体系为Taq Mix 12.5μL，引物各1μL，鼠尾裂解产物1μL，加去离子水至25μL。PCR扩增反应条件为 94℃ 预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃ 延伸40s，反应35个循环，72℃延伸2min。筛选cre/ERT2+/CAG-ZsGreen1+杂合鼠用于后续实验。

1.3.2 小鼠合笼 野生型和转基因小鼠分别按雌雄2∶1比例进行合笼，第2天早上检查阴栓，有阴栓的小鼠为E 0.5(embryonic stage 0.5)。出生后第1天的新生鼠为P1(postnatal day 1)。

1.3.3 他莫昔芬诱导重组 他莫昔芬100mg先后溶于预热的1ml无水乙醇和9ml玉米油中，配置成10mg/ml的溶液。孕鼠按100μg/g剂量腹腔注射，新生鼠按照80μg/g剂量腹腔注射。

1.3.4 冰冻切片 小鼠麻醉后经4%多聚甲醛灌注，4℃固定过夜。PBS清洗后，用10%～30%蔗糖梯度脱水，经OCT包埋剂-80℃包埋后，进行冰冻切片(厚度12～14μm)。

1.3.5 荧光定量PCR 分离的RPE组织用TRIzol法进行RNA提取，经RT反转录反应获得cDNA，1∶10稀释后进行荧光定量PCR。Prominin1的引物序列如下。正义链： 5′-GCCTCTACCCTGGAAG-CAAA-3′,反义链： 5′-GATGCTGGTGGATGGCTCTT-3′,产物长度为100bp。PCR反应体系为SYBR Premix Ex Taq II Mix 10μL,引物各1μL，稀释的cDNA 1μL，加去离子水至20μL。PCR扩增反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火100s，72℃延伸40s，反应40个循环。

1.3.6 免疫荧光染色 冰冻切片用PBS清洗3次后，用0.25%透膜液室温透膜20min；PBS清洗3次后3% donkey血清室温封闭30min，一抗按比例稀释后4℃ 孵育过夜；PBS清洗3次后二抗和DAPI按比例稀释后室温孵育1h；PBS清洗3次，用荧光抗衰减封片剂封片，荧光共聚焦显微镜成像。

1.4 统计学处理

数据用统计学软件SPSS 20.0进行配对样品t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转基因小鼠基因型的鉴定

引物Mutant1和Mutant2分别为转基因小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J的鉴定引物。用Mutant1和Mutant2引物进行PCR扩增后，产物经电泳可见320bp和199bp产物，说明转基因小鼠为Prom1cre/ERT2+/Gt(ROSA)26SorCAG-ZsGreen1+杂合鼠，见图1。

2.2 转基因小鼠示踪Prominin1在不同发育时期RPE的表达

孕13.5d(E13.5)、15.5d(E15.5)和出生后1d(P1)的新生鼠，分别腹腔注射他莫昔芬，7d收取胎鼠和新生鼠的眼球，冰冻切片后进行Otx2免疫荧光染色。由于RPE为色素上皮且表达Otx2，因此色素和Otx2可用于RPE的定位。E13.5和E15.5的胎鼠部分RPE中表达ZsGreen(图2A′～F′)，而P1小鼠的RPE中不表达ZsGreen(图2G′～I′)。示踪小鼠RPE中ZsGreen阳性表示此细胞在注射他莫昔芬时表达Prominin1，或者其可能来源于Prominin1阳性的细胞，因此本结果说明E13.5和E15.5时部分RPE可能表达Prominin1，而P1时的RPE不表达Prominin1。

2.3 荧光定量PCR检测Prominin1在不同发育时期RPE的表达

为了进一步验证示踪小鼠的研究结果，用定量PCR检测了Prominin1在野生型胎鼠和出生后小鼠RPE的表达情况。结果显示，Prominin1在胎鼠的表达明显高于出生后(P<0.01)；胎鼠中Prominin1在E13.5和E15.5高表达，均显著高于E10.5(P<0.05)和E17.5(P<0.01)，但两者间差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。出生后Prominin1的表达明显下降，其在P1与P4的RPE中表达无差异。此结果与转基因小鼠示踪的结果一致。

2.4 免疫荧光检测Prominin1在不同发育时期RPE的表达

为了进一步验证和探究Prominin1在不同发育时期RPE的表达，对E10.5、E13.5、E15.5、E17.5和P1的野生型小鼠RPE进行了Prominin1免疫荧光检测。结果与荧光定量PCR的结果一致，在胚胎期的小鼠RPE中可检测到Prominin1的表达(红色荧光)，出生后未见Prominin1的表达，见图4。其中E10.5、E13.5和E15.5的荧光较明显(图4A′～L′)，而E17.5的荧光较弱(图4M′～P′)。

图1 PCR鉴定转基因小鼠Fig.1 The detection of transgenic mice

图2 转基因小鼠示踪Prominin1在不同发育时期RPE的表达Fig.2 Tracing the expression of prominin1using genetically modified mice in developmental RPE孕鼠(A～F,A′～F′)和新生鼠(G～I,G′～I′)腹腔注射他莫昔芬7d后切片，用Otx2和DAPI进行染色，荧光共聚焦显微镜成像；标尺： A～F为100μm，G～I为200μm，A′～C′为25μm，D′～I′为50μm；TM： 他莫昔芬

图3 PCR检测Prominin1在不同发育时期RPE的表达Fig.3 The expression of Prominin1 in developmental RPE detected by RT-PCRE10.5与E13.5和E15.5的RPE比较，*P<0.05；胎鼠(E10.5，E13.5，E15.5，E17.5)与出生后(P1和P14)的RPE比较，**P<0.01；E10.5，E13.5和E15.5与E17.5的RPE比较，**P<0.01

3 讨 论

RPE是一层位于神经视网膜和脉络膜之间的单层色素上皮，其在支持、营养神经视网膜和维持视觉功能方面发挥着重要的作用[15]。因此，研究RPE的基因和蛋白表达对阐明RPE的生理和病理功能具有重要的意义。Prominin1是胆固醇结合糖蛋白，在多种上皮细胞中表达。但是其在RPE的表达尚未见报道。由于Prominin1位于细胞膜上表面的凸起，如微绒毛等，而RPE细胞上表面存在大量的微绒毛[16]，因此，推测RPE可能也表达Prominin1。

组织特异性遗传修饰小鼠是细胞体内示踪研究的重要工具[17]。其中，组织特异性Cre/ERT2重组酶转基因示踪小鼠和ROSA26-ZsGreen报告系统小鼠杂交的后代，可用于示踪组织特异性基因的表达。本研究使用Prominin1阳性细胞的示踪小鼠B6N;129S-Prom1tm1(cre/ERT2)Gilb/J和ROSA26-ZsGreen报告系统小鼠B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J杂交后代进行了示踪研究。本研究显示，胎鼠的RPE中表达Prominin1，而出生后的小鼠RPE不表达。此外，对野生型小鼠的RPE的定量PCR和免疫荧光染色显示，Prominin1主要在E13.5和E15.5达。与本研究不同的是，2011年，Jaszai等[14]利用原位杂交对胎鼠和出生后的小鼠视网膜进行研究，结果显示： Prominin1仅在神经视网膜光感受细胞外节和部分内核层细胞表达，而在RPE中未见Prominin1的表达。这种差异的原因可能是因为RPE为色素上皮，细胞内聚集大量的色素颗粒，这些色素对非荧光染色有一定的干扰。

Prominin1作为干细胞表面标志物，已经在神经和肿瘤等多种干细胞表面被发现[18-20]，但是其具体的功能尚不清楚。然而，对视网膜退行性疾病的研究发现Prominin1的c.1726C>T纯合突变可导致视网膜色素变性[10]；插入突变可导致光感受细胞营养不良；R373C的错义突变可导致家族性黄斑变性[11]。对R373C错义突变小鼠的进一步研究发现Prominin1的突变可影响光感受细胞外节的形态发生；电镜研究发现RPE内有脂褐素样物质的异常堆积。

图4 免疫荧光检测Prominin1在不同发育时期RPE的表达Fig.4 The expression of Prominin1 in developmental RPE of mice shown by immunofluorescence不同发育时期的胎鼠(A～P、A′～P′)和新生鼠(Q～T、Q′～T′)的冰冻切片，用Otx2、Prominin1和DAPI进行染色，荧光共聚焦显微镜成像；标尺： A～T为50μm，A′～D′为12.5μm，E′～T′为25μm

这些研究结果提示Prominin1的突变可能会导致RPE的异常。由于RPE对神经视网膜有营养、支持和保护等功能，其形态和功能的异常也会导致光感受细胞的异常[21]。因此，Prominin1是否参与RPE细胞质膜凸起的形成及其在RPE中的功能值得进一步研究。

综上所述，本研究首次证实了Prominin1在胎鼠RPE中表达，特别是在E13.5和E15.5的表达明显。本研究不仅丰富了Prominin1的组织表达谱，也为视网膜的生长发育及疾病发生的研究提供了新的线索。

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