齐红双，杨 瀚，刘 坤

(河南省南阳南石医院检验科，河南 南阳 473000)

医务人员手部微生物污染是造成严重的院内感染、多重耐药菌传播的重要危险因素[1，2]。医务人员保持手部卫生是预防医院院内感染的最为简单、经济实惠的途径，但如何对医务人员的手部卫生进行评估，尤其是对手部微生物评估仍然面临很多问题。此前，大部分医院多采用细菌培养法进行检测，但该方法耗时较长、结果存在延迟性以及操作复杂等局限性而限制了其推广使用[3]。近年来，关于ATP生物荧光法检测物体表面、医疗器械和医务人员手部污染菌量的研究显著增多[4，5]。该方法采用高灵敏度光度计对ATP、虫荧光素和荧光素酶反应发出的光进行检测，根据光的强度评估微生物的量，具有速度快、灵敏度高、结果可信等优点。但关于该方法检测结果的评估尚未形成统一标准，鉴于医务人员手部卫生质量监测频度及医院感染管理中的意义。本研究通过在我院应用ATP荧光微生物检验技术检验医务人员手部表面微生物，为其推广应用奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料2014年3月至2016年11月选择我院54名医务人员，包括27名护士、13名医生、14名医技人员，采用ATP荧光微生物检验技术对其手部表面微生物进行检测。

1.2试剂与材料BiotechTMBT-112D型生物荧光快速检测仪和BioThema 266-112型ATP生物荧光检测试剂盒，购自瑞典BioThema公司，检测精度为10-18mol ATP。ATP提取剂、荧光素酶、裂解液、ATP标准品(液态100 nmol/L)，均购自北京陆桥技术有限责任公司。金黄色葡萄球菌株(ATCC 6538)由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.3方法

1.3.1菌悬液制备 挑取单个金黄色葡萄球菌菌落接种于普通营养琼脂培养基斜面，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，再以生理盐水洗涤新鲜斜面培养物制成细菌悬液，采用活菌计数法进行计数。

1.3.2ATP生物荧光检测法 在医务人员手指屈侧，用UltansnapTMATP采样器以往返涂擦的方式进行采样，之后将采样棉拭子重新插回取样器，将取样器上方的塑料阀门折断，向其中反应液并进行震荡，充分反应后置入ATP生物荧光检测仪中进行分析，15 s后得出反应结果并记录，数据记录为相对光单位值(RLU)。

1.3.3医务人员手部微生物定量检测 参照GB15982-2012《医院消毒卫生标准》规定的方法进行操作，用采样棉拭沾取采样液从指根至指尖往返涂抹，再将该棉拭子在无菌条件下剪断放入10 ml采样液中，充分震荡洗脱后取适量洗脱液于无菌平皿内进行倾注培养，在37 ℃进行48 h培养，之后可进行计数。

1.3.4结果换算 取不同稀释度金黄色葡萄球菌悬液各 50 μl 加入无菌离心管内；再加入 50 μl裂解液，混匀后置室温放置 10 min；加入 400 μl 荧光素酶，迅速混匀。然后用 BiotechTM生物荧光快速检测仪测定第一次 RLU 值(M1)；加入10 μl ATP 标准品测定第二次 RLU 值(M2)；按照公式：ATP 含量(amol)=5 M1/(M2-M1)×105计算。

1.4评价标准规定医务人员手的细菌总数≤10 cfu/cm2为合格。ATP 生物荧光检测法的卫生标准，根据生产厂家在产品说明书中推荐的标准≤1 RLU/cm2(30 RLU/手)为合格。

1.5统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据处理。计量资料以均值±标准差表示，前后比较采用配对t检验；计数资料比较采用卡方检验；采用线性回归分析变量关系。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1金黄色葡萄球菌含量与ATP含量对应关系分析如表1所示，当金黄色葡萄球菌悬液含量在5.8×102～6.2×106时，随着菌数的增加，ATP含量也相应升高。以菌数对数值为横坐标，ATP含量对数值为纵坐标进行线性拟合，得线性回归方程Y= 1.0693X-0.0699，R2=0.9979，表明在该范围内，菌数对数与ATP含量对数存在良好的线性关系。见图1。

图1 金黄色葡萄球菌含量对数值与ATP含量对数值线性关系拟合

金黄色葡萄球菌含量cfu/ml对数值/0．5ml相对光单位值(RLU)M1M2ATP含量(amol)对数值(lgamol)6．2×1065．4953243879717665725．885．7×1054．43657386281412324．625．9×1043．455637889735943．565．6×1032．4951759743362．535．8×1021．46679387381．58

2.2活菌计数与ATP生物检测结果比较如表2所示，两种方法对医务人员手部卫生检查结果差异无统计学意义(χ2=0.940，P> 0.05)。

表2 两种方法对医务人员手部卫生情况评估结果

2.3ATP荧光微生物法对洗手前后医务人员卫生情况测定结果比较洗手后ATP含量显著低于洗手前(t=11.502，P< 0.05)。洗手后医务人员手表面微生物合格率显著高于洗手前(χ2=9.451，P< 0.05)，见表3。

表3 ATP荧光微生物法对洗手前后医务人员卫生情况测定结果

3 讨论

ATP荧光微生物检验的理论基础为所有生物机体体内均存在一定含量的ATP，通过荧光素酶催化荧光素和ATP发生反应生成能够产生荧光的荧光素氧化产物，且荧光强度与机体内ATP的含量呈正比，因此对机体ATP含量的检测可以间接反应微生物的含量[6]。目前，国内学者将ATP荧光微生物检测与传统的微生物培养法用于评估医疗器械的清洗效果，结果表明两种方法所得结果基本一致，这说明ATP荧光微生物检测的实际应用是可行的[7]。医务人员手部被微生物污染将会产生严重的安全风险，如交叉感染等，不仅对患者的健康产生威胁，而且也会对医务人员自身的健康产生隐患[8～10]。因此，建立对医务人员手部微生物污染的评估方法具有重要意义。

本研究结果表明当金黄色葡萄球菌悬液含量在5.8×102～6.2×106时，菌数对数与ATP含量对数存在良好的线性关系。这一结果说明菌数在一定范围内时，ATP含量能够与金黄色葡萄菌浓度相对应，可以通过测定ATP的含量用于评估微生物的含量，这与相关研究基本一致[11，12]

两种方法对医务人员手部卫生检查结果差异无统计学意义，上述结果说明ATP荧光微生物检验法对医务人员手表面微生物的评估结果与传统的微生物培养法的检验结果基本一致，间接反映了ATP荧光微生物检验用于医务人员手表面微生物评估的可靠性。相对于微生物培养法，该法能够在现场快速取样、测定，可在较短时间能拿到结果，有助于医务人员根据测定结果采取相应的应对措施。而常规的微生物培养一般需要在取样后24 h内才能观察结果，存在严重的滞后性，对实际工作的指导意义较差。

此外，本研究采用ATP荧光微生物检验法分别在医务人员洗手前后分别测定手部表面微生物情况，结果表明洗手后ATP含量显著低于洗手前，差异有统计学意义，洗手后，医务人员手表面微生物合格率显著高于洗手前。这一结果与实际情况相符，即通过洗手能够减少医务人员手表面的微生物[13]。通过应用该方法能够督促医务人员经常洗手，减少手部表面微生物数量，降低医务人员及患者交叉感染的风险。

综上所述，ATP荧光微生物检验技术能够用于评估医务人员手部微生物污染情况，结果与常规微生物培养法基本一致，可在实际工作中推广应用。

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