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(1.贵州省油料研究所，贵阳 550006； 2.贵州省油菜研究所，贵阳 550007)

在自然界中，细胞质雄性不育现象广泛存在，利用细胞质雄性不育系配置杂交种，是油菜杂种优势利用的重要途径之一，而选育具有强恢复性和优良农艺性状的恢复系却是获得杂交油菜强优势组合的关键[1]。恢复系恢复基因的分子标记与克隆不仅有助于提高恢复系的选育效率，而且有助于完整表述恢复基因与不育相关基因间的作用机理[2]。关于甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因研究的报道不少，Jean等[3]在分别含有恢复基因Rfp1和Rfp2的父本配制BC 1回交群体中，筛选出一个RFLP标记cRFlb与Rfp1和Rfp2完全连锁，由此认为，pol CMS的2个恢复基因Rfp1和Rfp2很可能是位于第18连锁群上的等位基因；Liu等[4]对恢复系714和湘油13的突变体681 A杂交获得的F2代分离群体进行了恢复基因的遗传和定位研究，发现突变体681 A的育性恢复受单一显性基因控制，获得的RAPD标记与恢复基因的遗传距离为5.47 cM；王俊霞等[5]找到了与甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育系育性恢复基因一侧的2个RAPD标记AH 19690和AI 16830，与育性恢复基因的遗传距离分别为5.9 cM和13.6 cM；同年又找到与育性恢复基因位于同侧的2个RAPD标记S 1019720和S 1036810，与该恢复基因的遗传距离分别为5.8 cM和12.3 cM，之后将2个RAPD标记分别转化成2个SCAR标记，并将其用于选育波里马细胞质不育的新恢复系。郭秀娟[6]以F2代分离群体结合BSA法对SSR引物进行筛选，在60对SSR引物中找到1对能扩增出多态性的引物0113-E 08-150 bp，其与育性恢复基因的遗传距离为5.13 cM。这些研究结果表明，已得到的分子标记与恢复基因的距离较远(>5 cM)，加上甘蓝型油菜的基因组较大，要顺利克隆恢复基因就有必要找到离恢复基因更近的分子标记。

SSR标记数量丰富，具有高多态性和共显性的特性，并具有易操作、易分析等优点，已被广泛应用于遗传图谱的构建、基因的定位及克隆、遗传多样性分析以及品种鉴定等方面的研究。本研究对不育系2116 A和恢复系Q 16 C进行遗传分析，期望筛选到与恢复基因紧密连锁的SSR标记，这样不仅在早期就能对油菜恢复系进行鉴定，还能为恢复基因的精细定位与克隆打下基础，推进恢复系和强优势杂交种的选育进程。

1 材料和方法

1.1 材 料

恢复系Q 16 C和不育系2116 A均由贵州省油料研究所三系课题提供，播种于贵州省油料研究所试验地内。2013年3月用不育系2116 A做母本与恢复系Q 16 C杂交得F1，2014年将F1单株套袋自交得F2，2015年于花期分3次调查F2群体的育性分离情况。

1.2 提取DNA和构建BSA池

在油菜苗期进行单株取样，使用改良的CTAB法提取亲本及F2群体的DNA，-80 ℃保存备用。参考R.W.Michelmore等[7]提出的BSA(bulked segregant analysis)构建方法，分别构建可育基因池和不育基因池：在F2群体中分别随机选取10株可育单株和10株不育单株，并将可育单株的DNA和不育单株的DNA分别等量混合，构成可育基因池和不育基因池。

注：M为marker ；P 1为父本；P 2为母本；1～6为可育株；7～10为不育株。图2 OS 31在亲本和F2单株间的部分表现

1.3 引物来源

参考公开发表的甘蓝型油菜SSR引物，从中选择98对引物由捷瑞公司合成。

1.4 PCR扩增及其电泳检测

PCR反应总体系12μL：DNA模板2μL，Mix体系6μL，引物1μL，ddH2O 3μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，10个循环，每个循环温度降低0.5 ℃，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物使用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离， 0.5×TBE缓冲液电泳，0.3%硝酸银染色，使用相机记录并分析实验结果。

1.5 遗传连锁分析

运用Kosambi作图函数将重组率转化为遗传距离(cM)，使用MapDraw软件绘制遗传连锁图[8]。其中交换率(%)=交换单株数/总株数×100%，(Kosambi)公式m=(1/4)ln[(1+2r)/(1-2r)]，m为作图距离，以cM为单位，r为重组率。

2 结果与分析

2.1 作图群体的不育株与可育株的比例调查

不育系2116 A和恢复系Q 16 C杂交，其F1代育性表现为可育。F1代自交获得F2代，最终得到具有230个单株的F2作图群体，其中，可育株为188株，不育株为51株，经过X2检测：p=0.19>0.05，符合3∶1的分离比例，说明不育系2116 A的育性是受1对显性核基因控制。

注：M为marker；P 1为父本；P 2为母本；F为可育池；S为不育池图1 OS 31在亲本和BSA池的多态性

2.2 SSR多态性引物筛选

选用98对引物分别对恢复系Q 16 C和不育系2116 A进行扩增筛选，结果表明，有23对引物在亲本间表现出多态性，使用这23对引物继续对可育基因池和不育基因池进行分析，结果表明，位于N 9染色体上的1对引物OS 31能在父本、母本、可育基因池和不育基因池中扩增出1条稳定的差异条带，即在父本和可育基因池中能扩增出1条长度约273 bp的特异条带，而在母本和不育基因池中则无扩增条带，结果如图1所示。理论上，可育基因池与不育基因池之间除恢复基因存在差异外，其它性状无差异，因此，OS 31标记可能与恢复基因有关。

2.3 单株验证和恢复基因的连锁分析

单株验证是基因池筛选的关键，因此使用F2群体对引物OS 31进行验证，部分结果如图2所示。结果表明，田间表现不育的51株单株中，有6株单株扩增出父本的带型标记；田间表现可育的188株单株中，有12株单株没有扩增出标记。说明该F2群体中共有18株单株发生了交换。根据交换率公式和Kosambi公式得到标记OS 31与恢复基因的距离为0.08 cM，连锁图谱如图3所示。

图3 OS 31与恢复基因(Rfp)的遗传距离

3 结论与讨论

恢复系的选育是杂交育种选育的重要环节，分子标记能对基因型进行直接选择，运用分子标记结合常规育种进行分子标记辅助选育，不仅可以提高恢复系选育的准确性，还可有效缩短恢复系的选育进程。本研究通过试验获得了1个与Q 16 C恢复基因紧密连锁的显性SSR标记OS 31，并通过公布的油菜遗传图谱将恢复基因Rfp初步定位在N 9连锁群，Ferreira等[9]认为，第1～10连锁群属于油菜的A基因组，即本试验说明恢复基因Rfp定位于油菜的A染色体上，这与前人的[10-13]的研究结果一致。通过计算，得到OS 31标记与恢复基因Rfp的遗传距离为0.08 cM，因此，本研究筛选出的OS 31标记可应用于油菜细胞质雄性不育恢复系的辅助选育，为油菜强优势杂交组合的选育提供了可能，也为Q 16 C恢复基因的进一步精细定位和克隆提供了参考。

[1]程计华,李云昌,梅德圣,等.几种农作物细胞质雄性不育恢复基因的定位和分子标记研究进展[J].植物学通报,2006(6):613-624.

[2]官春云,尹明智.利用SSR标记定位油菜细胞质雄性不育系1193 A的恢复基因[J].植物遗传资源学报,2015(2):364-367.

[3]Jean,M.,Brown,G.G.,Landry,B.S.Genetic mapping of nuclear fertility restorer genes for the ‘Polima’cytoplasmic finale sterility in canola (BrassicanapusL.)using DNA markers[J].Theor.Appl.Genet.1997,96:321-328.

[4]Liu,Z.,Guan,C.,Zhao,F.,et al.Inheritance and snapping of a restorer gene for the rapeseed cytoplastmic male sterile line 681 A[J].Plant Breed,2005,124:5-8.

[5]王俊霞,杨光圣,傅延栋.甘蓝型油菜PolCMS育性恢复基因的PCR标记[J].遗传学报,2000(2):575-578.

[6]郭秀娟.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系L 04-05 A育性分析及其恢复基因的SSR标记[D].甘肃农业大学,2009.

[7]Michelmore RW,Paran I,kesseli RV.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(21):9 828-9 832.

[8]刘仁虎,孟金陵.MapDraw在Excel中绘制遗传连锁图的宏[J].遗传,2003,25(3):317-321.

[9]Ferrira M E,WilliamsP H,Osborn TC.RFLP Mapping of Brassica napus using double-haploid lines[J].Theor Appl Genet,1994,89:615-621.

[10]朱家成,高玉千,张书芬,等.甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因的分子标记及定位[J].河南农业科学,2008(10):33-36,40.

[11]蔡强.甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp的分子标记筛选与初步定位[D].武汉:华中农业大学,2009.

[12]Li Y,Liu Z,Cai Q,et al.Identification of a microsatellite marker linked to the fertility-restoring gene for a polima cytoplasmic male-sterile line inBrassicanapusL.[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(47):9 563-9 569.

[13]Liu Zhi,Liu Pingwu,Long Furong,et al.Fine mapping and candidate gene analysis of the nuclear restorer gene Rfp for pol CMS in rapeseed (BrassicanapusL.)[J].Theoretical and Applied Genetics,2012,125(4):773-779.