杨俊霞+夏荪晖+张成标

[摘要] 目的 探讨β-甲基-环糊精（Methyl-β-cyclodextri，M-β-CD）对KCl刺激引起的原代培养的小鼠皮层神经元钙离子内流的影响。 方法 2016年9—12月，徐州医科大学麻醉学重点实验室，每个实验重复6次。将原代培养1周的小鼠皮层神经元随机分为3组：正常（Con）组、KCl组、M-β-CD -KCl组。采用荧光显微镜观察各组细胞内钙离子荧光强度的变化，采用流式细胞仪进一步检测各组细胞钙离子荧光强度的变化。 结果 荧光显微镜观察和流式细胞仪检测均显示0.1 mol/L KCl 作用于原代培养的小鼠皮层神经元 12 h，可使神经元胞内钙离子增加[M-β-CD -KCl组 vs KCl组：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）， P<0.01 ]。0.002 mol·L-1 M-β-CD预处理 25 min可明显降低KCl引起的细胞内钙离子的增加[M-β-CD -KCl组 vs KCl组：（1 093.89±6.53） vs （1 498.56±9.03），P<0.01]。 结论 β-甲基-环糊精可降低KCl引起的神经元胞内钙离子的增加。

[关键词] β-甲基-环糊精；KCl；神经元；钙离子

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）12（b）-0009-03

[Abstract] Objective To study the effect of Methyl-β-cyclodextri on the KCl-induced neuron calcium ion influx. Methods From Septmber to December 2016，Each experiment was repeated for 6 times in the Key Laboratory of Anesthesiology in the Xuzhou Medical University， and the primary cultured-cortical neuron of the mice was randomly divided into three groups： normal Con group， KCI group and M-β-CD-KCl group， and the changes of intracellular calcium fluorescence intensity of each group was observed by the fluorescence microscope， and the changes of fluorescence intensity of cell calcium ion of each group was further tested by the flow cytometry. Results The observation of fluorescence microscope and test of flow cytometry show that 0.1 mol/L KCll acts on the primary cultured-cortical neuron of the mice for 12 h， which can increase the intracellular calcium ion[M-β-CD -KCl group vs KCl group：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）， P<0.01]， and the pre-treatment of 0.002 mol·L-1 M-β-CD for 25min can obviously reduce the increase of intracellular calcium ion caused by KCI[M-β-CD -KCl group vs KCl group：（1 093.89±6.53） vs（1 498.56±9.03），P<0.01]. Conclusion The Methyl-β-cyclodextri can reduce the increase of intracellular calcium ion caused by KCI.

[Key words] Methyl-β-cyclodextri； KCI； Neuron； Calcium ion

β-甲基-环糊精（Methyl-β-cyclodextri，M-β-CD）对胆固醇有极强的亲和力，是一种常用胆固醇清除剂[1-2]，小窝（caveolae）是细胞膜上富含胆固醇和鞘脂的特定区域，含有多种与细胞生物学特性相关的膜受体，是细胞内外信号传递的重要通道，对细胞功能的调节发挥重要作用[3-4]。研究证实高浓度氯化钾（KCl）可使细胞膜电位升高，细胞膜上的电压依赖型钙离子通道开放，胞内钙离子升高[1]，该研究于2016年9—12月采用KCl刺激原代培养的皮层神经元模型，检测M-β-CD对KCl刺激引起的细胞内钙离子浓度的影响，以期揭示细胞膜上的小窝结构在KCl刺激引起的钙离子浓度升高中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 孕13 ～15 d小鼠，清洁级，由徐州医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 β-甲基-环糊精（C4555-1G，优级纯GR， SIGMA），Fluo 3-AM（46394， SIGMA），KCl（上海生工生物科技有限公司）；DMEM 培養基、Neuroasal Medium、B-27 添加剂、胰酶（Life Technology Inc）；胎牛血清（Biochem 公司）；L-多聚赖氨酸、二甲基亚砜（Sigma 公司）；其余为国产分析纯试剂。endprint

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠皮层神经元培养及各组神经元处理 取胎龄为13～15 d 的小鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，在D-Hank′s 平衡盐溶液中漂洗3次，尽量剔除脑膜，剪碎后用终浓度为0.25%胰酶，37℃消化10 min，离心，弃上清，用含15%胎牛血清的DMEM 培养基制备成1.0×109/L密度的细胞悬液，接种于预先用L-多聚赖氨酸包被的培养板中，置37℃、5% CO2培养箱内孵育。24 h后换成含2% B27的Neurobasal 继续培养，隔天换液。培养至第7天，换液，KCl组为终浓度为0.1 mol/L KCl 作用12 h，M-β-CD -KCl组为0.002 mol/L M-β-CD预处理25 min 后加入KCl，终浓度为0.1 mol/L，作用12 h。然后，将各组细胞用于后续实验。

1.2.2 荧光显微镜观察各组神经元胞内钙离子荧光强度的变化

用D-hanks液洗涤细胞3次，加入终浓度为5 μmol/L的Fluo-3/AM-DMSO D-hanks液， 在37℃孵育45 min，用D-hanks液洗涤细胞5次，每孔加入1 mL D-hanks液孵育20 min，荧光显微镜观察各组神经元胞内钙离子荧光强度。用 Image J 分析各组细胞荧光强度的变化。

1.2.3 流式细胞仪检测各组神经元胞内钙离子荧光强度的变化 用胰酶将细胞消化成单细胞悬液，移入离心管中1 000 r/min，5 min，弃上清，用D-hanks液重悬细胞，再次离心，1 000 r/min，5 min，弃上清，用D-hanks液2 mL重悬细胞，加入Fluo-3/AM-DMSO，使其终浓度为5 μmol/L，混匀，置入37℃水浴箱中避光孵育30 min，离心，1 000 r/min，5 min，弃上清，D-hanks重悬，离心，1 000 r/min，5 min，弃上清，D-hanks缓冲液1～2 mL重悬细胞，将细胞数调整为1×106/mL，上机检测。

1.3 统计方法

采用GraphPad Prism 5统计软件分析数据，各组数据以（x±s）表示。采用One Way ANOVA 法对实验结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察各组神经元胞内钙离子荧光强度的变化

0.1 mol/L KCl 作用于体外培养1周的小鼠皮层神经元12 h，可使神经元内钙离子明显增加。0.002 mol/L M-β-CD预处理 25 min可明显降低KCl引起细胞内钙离子的增加[M-β-CD-KCl组 vs KCl组：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32），P<0.01]（图 1）。

2.2 流式细胞术检测各组神经元胞内钙离子荧光强度的变化

流式细胞术检测大量神经元发现：0.1 mol/L KCl 作用于体外培养1周的小鼠皮层神经元12 h，可使神经元内钙离子明显增加。0.002 mol/L M-β-CD预处理25 min可明显降低KCl引起的细胞内钙离子的增加，[M-β-CD-KCl组 vs KCl组：（1093.89±6.53） vs （1498.56±9.03），P<0.01]，见图2。

3 讨论

脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，富含胆固醇和磷脂酰肌醇，研究显示，小窝是细胞膜上膜筏的重要一种，主要有胆固醇、鞘脂、小窝蛋白组成，是多种信号分子聚集进行信号交易的平台[5-7]。β-甲基-环糊精对胆固醇有极强的亲和力，是一种常用胆固醇清除剂，科学家常利用其对胆固醇的亲和力来破坏细胞膜的小窝结构研究细胞的多种生理和病理时细胞分子变化[1-2]，该研究也利用β-甲基-环糊精的这一特点来研究β-甲基-环糊精对KCl刺激引起的细胞内钙离子浓度的影响，证实小窝结构完整对细胞内钙离子浓度变化具有重要影响，小窝在细胞病理生理过程中扮演重要角色。现已证明，大脑皮质神经细胞经KCl刺激诱导表现出LTP，KCl可使细胞膜电位升高，当神经细胞的膜电位上升到一定值时，细胞膜上的电压依赖型钙离子通道开放，引起细胞内多种信号通路的激活。比如细胞受KCl刺激后引起膜的去极化，细胞外钙内流，激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinase， CAMK）及Ras/MAPK途径，通过级联反应磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB），激活脑源性神经营养因子（ brain derived neurotrophic factor， BDNF）发挥生物学效应。大脑皮质神经细胞经KCl刺激诱导表现出LTP，作为神经细胞活动最具特征性的表现方式，会引发各类基因表达并合成诸多蛋白质，从而使得神经细胞体现出不同的生物学功能[8-10]研究证实高浓度氯化钾可使细胞膜电位升高，细胞膜上的电压依赖型钙离子通道开放，胞内钙离子升高[1]，因此该研究采用高浓度氯化钾诱导细胞内钙离子变化，用β-甲基-环糊精预处理，采用荧光显微镜直接观察细胞内钙离子荧光强度变化，结果显示β-甲基-环糊精预处理可明显抑制高浓度氯化钾引起的胞内钙离子浓度的升高（M-β-CD -KCl组 vs KCl组：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）（##P<0.01）， 并结合流式细胞技术测定大量细胞钙离子荧光强度的变化，进一步确定了β-甲基-环糊精预处理可明显抑制高浓度氯化钾引起的胞内钙离子浓度的升高（M-β-CD -KCl组 vs KCl组：（1 093.89±6.53） vs （1498.56±9.03）（##P<0.01）， 荧光显微镜观察更直观的记录钙离子的荧光强度，流式细胞术可以使我们记录更多的细胞，实现大样本量采集数据，二者结合更有力的证明了β-甲基-环糊精预处理可有效降低高浓度氯化钾诱导细胞内钙离子浓度的升高。这与之前科学家研究采用流式细胞术全面检测胞内离子浓度变化时结果一致[11]，但是該研究采用荧光显微镜直接观察和流式细胞仪大样本记录更有说服力的证实了采用胆固醇清除剂β-甲基-环糊精破坏细胞膜表面小窝结构后，可抑制KCl引起的胞内钙离子升高。首次证实了，细胞表面小窝结构在KCl引起的胞内钙离子内流中起非常重要的作用，但是具体是通过小窝上钙通道还是钙/钙调素依赖性蛋白激酶或其它分子机制有待进一步研究。endprint