李永凯，张凤枰，廖利民，罗国强，苏艳秋，，曾娟，杨建英，曹毅

（1.通威股份有限公司，四川成都610000；2.河南科技大学，河南洛阳471000；3.四川大学，四川成都610000）

俗称“脑黄金”的二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），不仅是人体的必需脂肪酸[1-3]，而且对动物的生长发育和免疫有着特别重要的生理作用[4-7]。海洋产品中的鱼油是DHA的主要传统来源，随着海洋渔业资源日渐减少，新的DHA来源开发已成为迫切需求。裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）可发酵产DHA，其产业化生产成为研究热点[8-10]。发酵产品中DHA含量的准确测定是生产质控和科研中的一个重要环节，不但要求检测方法方便快捷，而且还需要检测方法具有较高的准确度。测量不确定度是国际上通用的衡量测量结果可靠性的指标，表征测量值的分散性[11]。它的正确评定在测量结果的客观分析中具有重要意义，能够量化测量结果的可信程度，使数据可以共享和比对。本研究采用气相色谱内标法检测裂殖壶菌固态发酵产物中DHA的含量，按照GUM等指南[11-13]，根据实验原理和方法建立数学模型，结合实验，分析检测过程中各分量不确定度来源并量化后，使用统计方法计算合成，得到样品DHA检测结果的标准测量不确定度和扩展测量不确定度，旨在为发酵产品中DHA含量的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Sartorius-CP225D电子分析天平：梅特勒-托利多国际有限公司；安捷伦7890A气相色谱仪（配FID检测器）：安捷伦科技（中国）有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DKZ-2恒温震荡水槽、HWS-26电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。

十三烷酸、二十二碳六烯酸、三十七种脂肪酸甲酯混标（10 mg/mL）、14%三氟化硼-甲醇溶液等：均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；盐酸、三氯甲烷、正己烷、甲醇、石油醚（60℃～90℃）、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠等：购自成都市科龙化工试剂厂；双蒸水：通威股份有限公司水产科技园实验室自制。

裂殖壶菌培养物样品：由成都通威水产科技有限公司提供。

1.2 检测方法

采用张凤枰等方法[14]，参照国家标准GB 5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[15]进行。

1.2.1 标准溶液的制备

十三烷酸内标溶液制备方法：准确称取500 mg十三烷酸标准品（准确至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至50 mL，得到10.0 mg/mL的内标溶液，储存于4℃冰箱备用。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 酸水解提取

裂殖壶菌培养物样品粉碎，混合均匀，称取0.5 g（精确至0.000 1 g），置于50 mL离心管中，准确加入10 mg/mL十三烷酸内标溶液1 mL，然后加入6 mol/L的盐酸溶液10 mL，混匀后置于60℃的恒温震荡水槽，震荡频度100次/min，时间30 min，取出后沸水浴5 min后，立即放入-20℃冰箱中冷冻8 h。冷冻消融后加入20 mL 三氯甲烷-甲醇（1∶1，体积比）混合溶剂，漩涡混匀2 min，然后8 000 r/min离心5 min，取氯仿层，加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，再次离心，将氯仿层移至干燥的250 mL磨口三角瓶中，旋转蒸发除去溶剂，得到油脂提取物。

1.2.2.2 油脂的皂化甲酯化

在所得油脂提取物的250 mL磨口三角瓶中加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液10 mL，置于100℃水浴上回流20 min后立即加入7 mL 13%～15%的BF3-CH3OH于沸腾的溶液中，继续煮沸，回流10 min。加入20 mL正己烷于沸腾的混合溶液中，停止加热，然后加入10 mL饱和氯化钠溶液，漩涡混合1 min，静置分层，移取3 mL上清液于洁净试管中，加入适量无水硫酸钠脱水，移取1 mL上层脱水溶液于样品瓶中待测备用。

1.2.3 气相色谱条件

色谱柱型号：Supelco SPTM-2560石英毛细管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm；汽化室温度设置：250℃；检测器温度设置：260℃；色谱柱初始温度设置60℃，然后以每分钟4℃升温到160℃，再以每分钟2℃升温到240℃；载气：高纯度氮气；分流比设置10∶1；色谱柱流速每分钟1.0 mL；尾吹流速每分钟40 mL；氢气流的速设置每分钟35 mL；空气的流速设置每分钟350 mL；进样量为 1 μL。

1.2.4 测定

气相色谱设备按上述条件设置，待气相色谱基线稳定后，分别进样检测标样、试样溶液，进行气相色谱检测分析。以峰的保留时间定性，内标法计算DHA的含量。

1.3 测量模型

式中：X为裂殖壶菌培养物中DHA的含量，mg/100 g；Fi为DHA校正因子；Ai为DHA气相色谱的出峰面积积分；AC13为十三烷酸甲酯的气相色谱出峰面积积分；CC13为十三烷酸内标溶液浓度，mg/mL；VC13为加入的十三烷酸内标溶液量，mL；m为裂殖壶菌培养物质量，g；1.065 6为十三烷酸的甲酯化的转化系数；0.959 0为DHA甲酯变成DHA的转化系数。

2 结果与讨论

裂殖壶菌培养物DHA含量的气相色谱内标法检测过程有6个环节引入了不确定度，分述如下：

2.1 校正因子测定环节

以脂肪酸甲酯混合标准溶液进样，用气相色谱做六次平行检测，用1.3模型公式计算校正因子，6次测定数值分别为 1.046 1、1.041 3、1.050 7、1.044 6、1.042 9、1.043 3。

标准不确定度采用平均值的标准偏差：

十三烷酸甲酯和二十二碳酸六烯酸甲酯的纯度均为99.9%，最大允差为0.1%。计算它们引入的相对标准不确定度urel（IS1）和urel（ISP）：

重复测定过程中产生的相对标准不确定度：

2.2 裂殖壶菌培养物样品称量环节

试验所用万分之一电子分析天平的不确定度为0.05 mg，按测量不确定度B类评定，均匀分布，K=计算由裂殖壶菌培养物样品称量环节产生的不确定度：

校正因子测定环节引入的相对标准不确定度：

2.3 十三烷酸内标溶液配制环节

试验所用的十三烷酸的纯度为99.0%，最大允差为1.0%，按照均匀分布计算相对标准不确定度：

十三烷酸称量所用分析天平与2.2相同，因此十三烷酸标准品称量产生的不确定度：

十三烷酸内标配制过程中器量校准引起的相对标准不确定度urel（ISV）：体积校准、定容操作、温度变化等分别引入 3 个分量 urel1（V）、urel2（V）和 urel3（V），3个分量的合成相对标准不确定度urel（V）计算结果见表1[16，17]。

表1 单标线吸量管、单标线容量瓶的相对标准不确定度Table 1 The relative standard uncertainty of suction pipet and volumetric flask

试验中使用50 mL容量瓶引起的体积相对标准不确定度：

综上，计算十三烷酸内标溶液配制环节引入的相对不确定度：

2.4 内标使用环节

使用1 mL吸量管加入十三烷酸内标环节引入的相对标准不确定度

2.5 重复检测环节

裂殖壶菌培养物平行检测6次，结果是每百克样品中含 DHA 的毫克数分别是 719.0、684.0、693.0、702.5、715.3、669.0，平均值为697.1，计算标准不确定度：

2.6 加标回收试验环节

加标回收试验按3个水平，每个水平做2个重复进行实验，结果见表2。

重复检测环节引入的相对标准不确定度：

表2 样品回收率测定值Table 2 The result of spike recovery

计算标准不确定度：

加标回收试验环节引入相对测量不确定度：

2.7 合成总不确定度

由以上6个环节的不确定度计算合成不确定度

合成标准不确定度uc（X）：

uc（X）=ucrel（X）×X=9.8 mg/100 g

各分量不确定度按正态分布分析处理，根据正态分布，包含因子k=2，对应包含概率p=95%，扩展不确定度U计算结果如下：

U=k×uc（X）=19.6 mg/100 g

2.8 测量不确定度报告

裂殖壶菌培养物中的DHA含量：X=（697.1±19.6）mg/100 g，k=2

2.9 讨论

以各不确定度分量值做图进行直观分析，如图1所示。

图1 测量不确定度分量示意图Fig.1 Distribution diagram of each component of uncertainty

试验过程中重复测定环节所引入的不确定度分量（1.12%）最大，称量操作环节引入的不确定度分量（0.005 8%）最小。前者是后者的193倍。十三烷酸内标溶液配制、内标添加量、回收率、校正因子等分量不确定度介于0.15%和0.58%之间，各分量数值相差不大，但也不容忽视。本试验结果与张凤枰[14]研究结果相一致。通过以上分析，可以看出实验手工操作部分带来的不确定度相对较大，提示我们操作人员在检测实验中，应注意提高实验操作技能，降低相关不确定度分量。

3 结论

根据气相色谱内标法测定裂殖壶菌培养物中DHA含量的检测方法和原理，建立数学模型，通过实验数据统计评定得出：裂殖壶菌培养物DHA含量的重复测定环节所引入的不确定度分量最大，称量操作环节最小，前者是后者的193倍；样品中DHA含量检测值697.1 mg/100 g，合成标准不确定度9.8 mg/100 g，扩展不确定度19.6 mg/100 g。

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