杨逢源，王雁萍，赵珊珊，郭琳娜，曹 丹(郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室，河南 郑州 450052)

苜蓿(Medicagosativa)富含粗蛋白、粗脂肪及其他营养物质，是广泛种植的经济牧草。刘会芳等[1]对苜蓿、小麦(Triticumaestivum)及玉米(Zeamays)经济效应研究表明，现阶段小麦和玉米处于规模报酬递减阶段而苜蓿处于规模报酬递增阶段，苜蓿产业有很大的上升空间。青贮是牧草贮藏的常用技术，青贮过程中，乳酸菌主要利用牧草中的可溶性糖产生乳酸，降低牧草的pH，防止腐败菌大量生长造成牧草中蛋白等营养物质的降解。同时，饲喂青贮苜蓿对牲畜代谢能力有一定积极影响。李改英等[2]研究发现，与相同干物质含量的干草相比，饲喂苜蓿青贮饲料有利于改善奶牛的生产性能和机体代谢能力。新鲜牧草中乳酸菌数量较低，且多为异型发酵菌株[3-4]，因此产酸及耐酸性能较好的同型发酵的植物乳杆菌成为牧草青贮中常用的添加剂。

然而，苜蓿可溶性糖含量较低，致使乳酸菌无法正常生长且无法生成充足的乳酸，因此自然青贮往往无法达到理想的效果。万里强等[5]发现，添加乳酸菌的同时添加纤维素酶能够有效提高苜蓿青贮品质。董治国等[6]研究表明，糖蜜与复合菌共同作为添加剂，苜蓿能在较高水分下青贮。李改英等[7]研究表明，添加糖蜜明显改善苜蓿青贮饲料的感官品质,提高其粗蛋白质及乳酸含量,降低了铵态氮和总氮的比值以及饲料的pH。然而，直接添加外源添加剂或会增加青贮成本，同时在工业青贮中会增加操作难度。因此，提高乳酸菌分解纤维素性能有可能是解决苜蓿青贮困境的有效途径。Ozkose等[8]将纤维素酶基因转入乳酸乳球菌IL403和MG1363中构建重组菌株，作为青贮添加剂可有效降低其中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。这为乳酸菌转基因工程菌的生产与应用打下了良好基础。本研究采用N+注入的方法对植物乳杆菌进行诱变，以期选育低可溶性糖环境中发酵产酸性能优良的突变菌株。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及试剂

本研究中所用菌株如表1所列。

表1 试验菌株及来源Table 1 Name and origin of bacterial strains

ZZU A345分离自山西省的苜蓿样品，具有良好的产酸能力，抑菌性能及葡聚糖利用能力，保存于郑州大学离子束生物工程实验室。

试验中所用专门试剂及培养基成分：诱变保护剂(0.02%透明质酸钠，3%海藻糖)；MRS-CMC培养基为由MRS培养基改良的筛选培养基，添加1%羧甲基纤维素钠，固体培养基葡萄糖含量为1%，液体培养基葡萄糖含量为0.4%。

1.2 诱变及筛选

1.2.1N+注入 将出发菌株于MRS-CMC固体培养基上30 ℃培养48 h。挑取出发菌株于4 mL诱变保护剂中，振荡均匀，调整菌液OD600值至0.6。吸取50 μL菌液在培养皿中央均匀涂布直径约2 cm，以保证涂布面为单层细菌。

将培养皿上的乳酸菌进行N+注入，剂量分别为1×1015、5×1010和1×1010ion·cm-2。向离子注入后的培养皿中加入无菌水浸泡，用橡胶块擦洗皿底辐照后的菌斑，将菌液吸回MRS-CMC液体培养基，取部分菌液稀释涂布MRS-CMC固体培养基平板，统计致死率，其余菌液置于30 ℃培养箱培养24 h，用于目标菌株的分离、纯化及筛选。

1.2.2辐照致死率测定 采用平板计数法进行菌落计数。

致死率=(1-注入后菌落数/注入前菌落数)×100%。

1.2.3菌株的筛选 对Teather的刚果红染色法[9]进行改良，通过添加微量葡萄糖，建立了一种更加适应乳酸菌生长情况的筛选方法：

诱变后菌株在液体培养基中30 ℃培养24 h后，稀释涂布于MRS-CMC固体培养基，待形成单菌落后随机挑取单菌落进行编号并扩大培养。将培养好的菌用牙签点菌至MRS-CMC固体培养基，培养72 h后用刚果红染色，根据染色出圈直径与菌落直径的比值判断菌株对纤维素的降解情况，保存透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株。

1.2.4发酵苜蓿草粉实验 将苜蓿放置于65 ℃烘箱48 h烘干水分，利用粉碎机将其粉碎，过0.069 mm筛子，制备苜蓿草粉备用。将筛选出的菌株活化后接种于MRS-CMC液体培养基，30 ℃培养24 h，制备乳酸菌菌液备用。称取苜蓿粉1 g于自封袋中，按66.7%的含水量加2 mL无菌水，在装有上述苜蓿粉的自封袋中，以加入300 μL乳酸菌菌液的为加菌处理组，以不加菌的作为对照组(CK)，每组设置3个重复，混匀，密封，放置于30 ℃培养箱。分别培养0、24、48 h后开封，开封后每袋样品中加入27 mL蒸馏水，充分混匀，测定其pH，并进行统计分析。

1.2.5纤维素酶活的测定 将供试菌株于MRS-CMC液体培养基中30 ℃培养24 h后，4 000 r·min-1室温离心10 min，用无菌水清洗后制备为500 μL菌悬液，取100 μL转接至不含葡萄糖的MRS-CMC液体培养基中30 ℃培养48 h。以羧甲基纤维素钠为反应底物，采用DNS法[4]测定纤维素内切酶酶活，每个菌株设置3个重复。

1.3 苜蓿青贮试验

1.3.1青贮材料的准备及乳酸菌的培养 将初花期收获的苜蓿材料室温晾晒至含水量约为60%，截至2～3 cm长。乳酸菌于MRS液体培养基中30 ℃培养12 h。取100 g苜蓿样品装于自封袋中，处理组加入100 μL菌液，对照组不添加菌液，混匀后抽真空密封，置于室温(约25 ℃)，每组样品均设置3个重复。

1.3.2青贮品质及化学成分分析 使用AOAC法测定样品干物质含量。将样品于烘箱65 ℃干燥48 h后粉碎，凯氏定氮法[10]测定其粗蛋白含量(海能K1100全自动凯氏定氮仪)。取10 g样品与90 mL水混匀，经0.45 μm滤膜过滤后测定其有机酸成分(Alliance，Waters e2695)。有机酸种类及含量采用高效液相色谱法测定[10]。柱子规格：Carbomix H-NP 10 μm，8%，7.8 mm×300 mm)，流动相为0.0254%的硫酸，流速为0.6 mL·min-1，柱温55 ℃，检测波长214 nm，进样量为10 μL。

1.4 数据统计及分析

采用Excel 2016进行数据处理和均值统计，并通过SPSS 21.0软件进行方差统计分析。

2 结果及分析

2.1 辐照致死率

出发菌株ZZU A345在不同剂量N+辐照下致死率如表2所列，致死率随着辐照剂量的增加而提高，当剂量为1×1016ion·cm-2时，致死率达到99.94%。

表2 ZZU A345辐照致死率Table 2 Radiation lethality of ZZU A345

同列不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different mutagenic dose treatments at the 0.05 level; similarly for the following tables.

2.2 突变菌株的筛选

对ZZU A345进行N+注入后，筛选出生长于MRS-CMC培养基平板上刚果红染色后透明圈直径最大且性状能够稳定传代的突变菌株345-177。以345-177作为出发菌株，进行了第2轮N+注入。以注入后透明圈直径与菌落直径比值大于出发菌株为正突变，反之为负突变，第2轮诱变正突变率为42.4%，负突变率为57.6%。根据对透明圈直径测量结果，筛选出对羧甲基纤维素具有较好降解作用的突变菌株zw1-33、zw2-8、zw2-21、zw2-2和zw3-57。其中zw1-33为经过1×1015ion·cm-2剂量辐照后筛选得到，zw2-8，zw2-21和zw2-23为经过5×1015ion·cm-2剂量辐照后筛选得到，zw3-57为经过1×1016ion·cm-2剂量辐照后筛选得到。

2.3 发酵苜蓿草粉性能

为评估突变菌株在苜蓿青贮中的潜在能力，按照通常苜蓿青贮时设置的干物质含量进行苜蓿草粉发酵试验。在接种0 h后，各组间pH差异不显著(P>0.05)(表3)。发酵24 h后，处理组pH显著低于(P<0.05)对照组，且添加突变菌株的处理组pH均低于添加出发菌株ZZU A345的处理组，其中添加突变菌株zw1-33或zw3-57与添加出发菌株ZZUA345的处理组相比有显著差异。发酵48 h后，除添加zw2-23的处理组pH升高外，其余处理组的pH均有所降低，并趋向于同一水平。

表3 菌株发酵苜蓿草粉不同时间的pHTable 3 Changes of pH with time in the fermentation test

2.4 菌株的纤维素内切酶活性

出发菌株ZZU A345及诱变后突变菌株的纤维素内切酶酶活测定结果表明，ZZU A345的酶活性为4.50 μg· (mL·min)-1，345-177为4.65 μg· (mL·min)-1，zw1-33为4.52 μg· (mL·min)-1，zw2-21为5.01 μg· (mL·min)-1，zw3-57为4.94 μg· (mL·min)-1。虽然诱变前后菌株间纤维素内切酶酶活没有显著差别(P>0.05)，但突变菌株的酶活均略高于出发菌株ZZU A345。

2.5 苜蓿青贮65 d的发酵品质及营养价值

苜蓿收割后对其化学成分进行分析，在青贮前苜蓿样品的干物质含量为38.78%,pH 6.15，粗蛋白含量为21.28%。样品中未检测到乳酸、乙酸、丙酸及丁酸成分。

在苜蓿青贮中以不加菌的为对照组(CK)，分别添加菌株ZZU A345及突变菌株zw2-21的为处理组，青贮65 d，青贮样品的pH及有机酸含量如表4所列。添加zw2-21的处理组pH显著低于对照组(P<0.05)，且乳酸含量最高。青贮65 d后，各组样品均未发生腐败，未检测到丙酸或丁酸。添加突变菌株zw2-21的处理组乳酸含量显著高于添加出发菌株ZZU A345的处理组(P<0.05)。各组苜蓿样品的干物质及粗蛋白含量差异不显著(P>0.05)。

表4 青贮65 d苜蓿pH及有机酸含量Table 4 pH and organic acid content after 65 d ensiling

3 讨论

乳酸菌添加剂能够有效提高牧草青贮质量[11-13]。然而，苜蓿可溶性糖含量低，纤维类物质含量高，致使乳酸菌无法正常生长和产生足量乳酸。为提高苜蓿青贮初期的可溶性糖含量，增加其纤维类物质的降解是一种可能的方式。Siezen等[14]发现，植物附生的一些天然乳酸菌具有编码部分植物多糖分解相关酶的基因簇，这为选育具有内切-1,4-β-葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶等纤维类物质分解酶酶活性较高的乳酸菌提供了研究基础。离子注入方法不仅在纤维降解黑曲霉、里氏木霉和解淀粉芽孢杆菌菌种选育中广泛应用[15-18]，也同样被运用于乳酸菌菌种选育。利用离子注入的方法，研究者[19-20]分别在选育共轭亚油酸及L-乳酸高产植物乳杆菌菌株方面均取得了良好效果。本研究应用N+注入植物乳杆菌，筛选出降解纤维素及发酵苜蓿粉产酸能力均有提高的突变菌株zw2-21及zw3-57。

乳酸菌利用纤维素生长的能力较弱，本研究对Teather和Wood[9]的纤维素酶活测定方法进行改进，添加少量葡萄糖促进乳酸菌的生长，并以同样方式对乳酸菌进行预处理，再使用DNS法测定其酶活，建立了有效的乳酸菌纤维素酶活测定方法。

在苜蓿青贮中，添加突变菌株zw2-21的处理组乳酸含量最高。乳酸能够有效降低青贮饲料的pH，抑制腐败发生，同时能够改善饲料口感。添加zw2-21的处理组pH在各组青贮样品中最低，这与其乳酸含量较高的测定结果是一致的。乙酸具有一定的抑菌效果，但其刺激性气味或对牧草口感产生影响，进而影响牲畜的摄食量。干物质含量是反应牧草有效营养成分的重要指标，本研究中，自然青贮未出现霉变腐烂，且添加乳酸菌添加剂与否并未对青贮样品的干物质及粗蛋白含量产生显著影响，可能与研究材料自身成分和附着微生物适于青贮有关。

4 结论

经过N+注入诱变选育所得突变菌株zw2-21的纤维类物质分解能力及发酵苜蓿粉产酸能力均有所提高，且在苜蓿青贮中有效提高了乳酸含量，降低了青贮饲料的pH。因此，应用N+注入诱变的方法能够有效提高乳酸菌对纤维类物质的降解能力，得到的突变菌株在苜蓿青贮应用中具有潜在的应用价值。

References:

[1] 刘会芳,南志标,唐增,王丽佳.苜蓿、小麦、玉米经济效益比较.草业科学,2016,33(5):990-995.

Liu H F,Nan Z B,Tang Z,Wang L J.Comparison of economic benefit of alfalfa,wheat and maize:A case study in Gansu Province.Pratacultural Science,2016,33(5):990-995.(in Chinese)

[2] 李改英,廉红霞,孙宇,傅彤,高腾云.青贮紫花苜蓿对奶牛生产性能、尿素氮和血液生化指标的影响.草业科学,2015,32(8):1329-1336.

Li G Y,Lian H X,Sun Y,Fu T,Gao T Y.Effects of alfalfa silage on production perfermance,urea nitrogen and blood biochemical index in dairy cow.Pratacultural Science,2015,32(8):1329-1336.(in Chinese)

[3] Cai Y.Identification and characterization ofEnterococcusspecies isolated from forage crops and their influence on silage fermentation.Journal of Dairy Science,1999,82(11):2466-2471.

[4] Cai Y,Benno Y,Ogawa M,Ohmomo S,Kumai S,Nakase T.Influence ofLactobacillusspp. from an inoculant and ofWeissellaandLeuconostocspp. from forage crops on silage fermentation.Applied and Environmental Microbiology,1998,64(8):2982-2987.

[5] 万里强,李向林,何峰.添加乳酸菌和纤维素酶对苜蓿青贮品质的影响.草业科学,2011,28(7):1379-1383.

Wan L Q,Li X L,He F.The effects of adding lactic acid bacteria and cellulase on alfalfa silage quality.Pratacultural Science,2011,28(7):1379-1383. (in Chinese)

[6] 董治国,任玉平,王建明.糖蜜与复合菌处理对不同含水量苜蓿青贮效果的研究.中国牛业科学,2014,40(6):15-17.

Dong Z G,Ren Y P,Wang J M.Study on the silage effect of molasses and compound bacteria for different moisture of alfalfa.China Cattle Science,2014,40(6):15-17. (in Chinese)

[7] 李改英,高腾云,傅彤,孙宇.糖蜜和农副产品复合添加物对苜蓿青贮品质的影响.湖北农业科学,2007,46(5):813-816.

Li G Y,Gao T Y,Fu T,Sun Y.Effects of molasses and agro-byproducts compound supplement on the quality of alfalfa silage.Hubei Agricultural Sciences,2007,46(5):813-816. (in Chinese)

[8] Ozkose E,Akyol I,Kar B,Comlekcioglu U,Ekinci M S.Expression of fungal cellulase gene inLactococcuslactisto construct novel recombinant silage inoculants.Folia Microbiologica,2009,54(4):335-342.

[9] Teather R M,Wood P J.Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterisation of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.Applied and Environmental Microbiology,1982,43(4):777-780.

[10] Schwartz D P.Methods for the isolation and characterization of constituents of natural products:ⅩⅪ.Use of a celite-potassium methylate column for rapid preparation of methyl esters from microgram amounts of glycerides.Microchemical Journal,1977,22(4):457-462.

[11] Ni K K,Wang Y P,Li D X.Characterization,identification and application of lactic acid bacteria isolated from forage paddy rice silage.PLoS ONE,2015,10(3):eo121967.

[12] 侯建建,白春生,张庆,玉柱.单一和复合乳酸菌添加水平对苜蓿青贮营养品质及蛋白组分的影响.草业科学,2016,33(10):2119-2125.

Hou J J,Bai C S,Zhang Q,Yu Z.Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa.Pratacultural Science,2016,33(10):2119-2125. (in Chinese)

[13] 赖玉娇,罗海玲,王朕朕,卢晓楠,曲扬华,高维敏,刘昆,玉柱.添加不同乳酸菌剂对苜蓿青贮营养价值的影响.中国畜牧兽医,2014,41(8):111-116.

Lai Y J,Luo H L,Wang Z Z,Lu X N,Qu Y H,Gao W M,Liu K,Yu Z.Research progress on aflatoxin and its antidote in animal nutrition.China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2014,41(8):111-116. (in Chinese)

[14] Siezen R J,Starrenburg M J,Boekhorst J,Renckens B,Molenaar D,Vlieg J E.Genome-scale genotype-phenotype matching of twoLactococcuslactisisolates from plants identifies mechanisms of adaptation to the plant niche.Applied and Environmental Microbiology,2008,74(2):424-436.

[15] Wang S Y,Jiang B L,Zhou X,Chen J H,Li W J,Liu J,Hu W,Xiao G Q,Dong M Y,Wang Y C.Study of a high-yield cellulase system created by heavy-ion irradiation induced mutagenesis ofAspergillusnigerand mixed fermentation withTrichodermareesei.PLoS One,2015,10(12):e0144233.

[16] Jiang B L,Wang S Y,Wang Y C,Chen J H,Li W J,Liu J,Hu W,Xiao G Q,Dong M Y,Xu F.A high-throughput screening method for breedingAspergillusnigerwith12C6+ion beam-improved cellulase.Nuclear Science and Techniques,2017,28(1):1-7.

[17] Li Z Z,Chen X J,Li Z L,Li D M,Wang Y,Gao H L,Cao L,Hou Y Z,Li S B,Liang J P.Strain improvement ofTrichodermaviridefor increased cellulase production by irradiation of electron and12C6+-ion beams.Biotechnology Letter,2016，38(6):983-989.

[18] Sangwijit K,Jitonnom J,Pitakrattananukool S,Yu L D,Anuntalabhochai S.Low-energy plasma immersion ion implantation modification of bacteria to enhance hydrolysis of biomass materials.Surface and Coating Technology,2015，306(A):336-340.

[19] 李淑荣,孟宪军,张涛,赵宏伟,吕加平,赵芸,高艳红,李庆鹏.离子注入诱变植物乳杆菌选育CLA 高产突变株的研究.核农学报,2009,23(5):794-798.

Li S R,Meng X J,Zhang T,Zhao H W,Lyu J P,Zhao Y,Gao Y H,Li Q P.Screening of aLactobacillusplantarummutant with high CLA productivity induced by N+implantation.Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2009,23(5):794-798.(in Chinese)

[20] 吕平,杨柳枝.高产L-乳酸菌的选育及其发酵特性的研究.化工科技市场,2006,29(11):41-45.

Lyu P,Yang L Z.Mutation and fermentation characteristics of high L-lactic acid producing strains.Chemical Technology Market,2006,29(11):41-45.(in Chinese)