高雪梅，张志

（吉林农业科技学院制药工程学院，吉林吉林132101）

恩诺沙星（Enrofloxacin），又名恩氟奎林羧酸，属于第三代奎诺酮类之化学合成抑菌剂，是动物专用抗菌药物，对革兰氏阴性杆菌、格兰仕阳性菌和葡糖糖非醇都具有很强的活性，杀菌活性强、体内分布广泛，与其他抗菌药物无交叉耐药性，已经广泛用于国内外的兽医临床[1,2]。临床上主要用于动物大肠杆菌、分支杆菌和禽大肠杆菌的感染。但其会出现胃肠道反应、过敏反应、心血管反应、中枢神经系统症状、肝肾功能异常、支气管哮喘、低血糖等不良反应和毒副作用，并且长期用药产生的耐药性问题也日趋严重[3]，其原因与喹诺酮类药物在动物方面的使用量增加有关。为了监控喹诺酮类药物在畜禽养殖业的应用，我国农业部发布了第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》，在2002年对恩诺沙星在鸡组织中的残留标志物（恩诺沙星及其代谢物环丙沙星之和），残留限量为：100～300 μg/kg，肌肉0.1mg/kg，肝脏0.2 mg/kg，肾脏0.3 mg/kg[4]。中华人民共和国农业部第278号公告对各种动物使用恩诺沙星的休药期都作了规定，其中恩诺沙星用于鸡的休药期为8d[5]。希望通过本研究能够找到恩诺沙星微球在动物体内的代谢规律，为实现恩诺沙星新剂型的开发提供临床使用依据。

1 材料与方法

1.1 试验试剂与药品

恩诺沙星淀粉微球，批号20160803，自制。恩诺沙星对照品，含量99.16%；环丙沙星对照品，含量84.2%，均由中国兽医药品监察所提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验动物

35只黄羽肉鸡，40日龄，体重为（1.5±0.2）kg，公母各半，由吉林农业科技学院养殖场提供。

1.3 给药与采样

适应期过后，分别临床推荐剂量的高限（以恩诺杀星计，1L饮水，鸡100mg）饮水给药，连续饮水7d后停药。在停药后4h（即零休药期）、1d、3d、5d、7d、9d、11d共7个时间点，每个时间点宰杀5只鸡进行采样。鸡经颈静脉放血处死，取出100～200g肌肉/每只鸡，取全肝，取全肾。采集后的所有组织样品不进行任何处理，立即放入包装袋并做好标记，放入冰箱-20℃中保存备用。

1.4 测定方法

1.4.1 样品的预处理

称取一定量的采集样品，置30 mL匀浆杯中，加定量磷酸盐缓冲液，10000 r/min匀浆1 min，匀浆液转入50 mL聚丙烯带盖离心管中，振荡混合5 min，4000 r/min离心10 min，然后将上清液置于25 mL离心管中。用定量磷酸盐缓冲液清洗匀浆机内部，将剩余的残渣都放入50 mL离心管，搅拌均匀，并且离心分离，最后合并所有上清液倒入25 mL离心管中备用。C18固相萃取柱按次序用2 mL甲醇，2 mL水润洗，洗完之后精密量取5 mL备用液过柱，然后用2 mL的水淋洗挤干。再加入流动相1.0 mL洗脱挤干，最后洗脱液全部收集。经0.45 μm微孔滤膜过滤得待测溶液。

1.4.2 高效液相色谱条件

色谱柱：C18（150mm×4.6 mm，5μm）；粒径5μm；流动相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺-乙腈（82-18），用前过0.45μm滤膜；流速0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样量：20μL。

在选定的高效液相色谱条件下，恩诺沙星、环丙沙星均可以与其他组分分开，恩诺沙星保留时间在8.5min左右，环丙沙星保留时间在7min左右。该法检测限为20μg/kg，恩诺沙星与环丙沙星进行回收率试验，其回收率都在70%以上，批内和批间变异系数分别小于8%和10%。标准曲线在0.01μg/mL～1μg/mL浓度范围内，恩诺沙星的线性回归方程为:y=4871.4x-0.8632，相关系数r=0.9996；环丙沙星为:y=2786.5x+1.4865，相关系数r=0.9998，线性关系良好。

2 结果与分析

2.1 各组织样品检测的色谱图

鸡空白肝脏色谱图见图1；恩诺沙星和环丙沙星休药4h后肝脏色谱见图2。

2.2 鸡各组织中恩诺沙星与环丙沙星残留测定结果

分别在0d、1d、3d、5d、7d、9d、11d进行采集鸡组织，按上面“样品预处理”方法进行处理后，通过HPLC测定环丙沙星（CIP）和恩诺沙星（ENR）的残留量结果，通过公式计算得到恩诺沙星淀粉微球饮水停药后，不同休药时间鸡各组织中ENR和CIP的残留量总和（见表1）。

由表1可知，恩诺沙星淀粉微球在零休药期时，肌肉、肝脏和肾脏中恩诺沙星残留物的平均残留量分别为3.5674mg/kg、5.9202mg/kg和1.3828 mg/kg。在停药5d后，在鸡的肌肉组织和肝脏组织中的总残留含量仍然高于最高残留量（MRL），肾脏组织的总残留量在停药第3d已经降到0.0395 mg/kg，低于《动物性食品中兽药最高残留限量》中的MRL。停药7d后，肌肉和肝脏的总残留量降至相应的MRL以下，第9d以后均为检测出残留量。恩诺沙星及主要代谢产物环丙沙星在肝脏中残留量较高，且消除相对缓慢，药物在肾脏中的残留量均低于同期的肝脏。而在肌肉组织中代谢消除较快，残留量下降迅速。

图2 肝脏休药后4h色谱图

表1 恩诺沙星淀粉微球饮水停药后不同休药时间ENR和CIP残留量（mg/kg）

3 讨论

恩诺沙星淀粉微球饮水给药，在临床上给药的方案是连续用药5d，本实验采取连续饮水用药7d的方案，是以用药的最大量降低因实际使用药物的过程中，出现的残留危害。以ENR以及ENR的主要代谢物CIP残留总量为标示残留物，通过测定鸡内标示残留物的量，结果指出，恩诺沙星淀粉微球按推荐剂量的最大限量用药，该药物剂型在鸡各组织中的总残留量在用药7d低于国家最高残留限量。从鸡的肌肉组织、肝脏组织和肾脏组织中的总残留量的消除情况来看，本实验建议恩诺沙星淀粉微球这种剂型的休药期为7d。

[1] 中国兽药典委员会编.兽药使用指南[M].北京:中国农业出版社，2006.

[2] D.J.Dimitrova,L.D.Lashev,S.G.Yanev,B.Pandova.Pharmacokinetics of enrofloxacin in turkeys[J].Research in Veterinary Science,2007(82):392-397

[3] 杜锋.恩诺沙星、环丙沙星在鸡组织中残留量的检测方法研究[J].中国兽药杂志，1999(04):5-8.

[4] 毛浩玉.喹诺酮类抗菌药不良反应及其机制研究现状[J].国外医药抗生素分册,2004,25(01)：23-26.

[5] 中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量[S].2002.

[6] 中华人民共和国农业部公告第278号.兽药停药期规定[S].2003.