马俊飞， 丁承超， 谢曼曼， 曾海娟， 郭 亮， 汪冠豪， 刘 箐

(上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海 200093)

疫苗在动物疫病和人类传染病的预防和治疗中发挥着巨大作用，传统疫苗(灭活苗、弱毒苗)显露出免疫效果差、安全性低等诸多的局限性，已经不足以应对当今新疾病泛滥的严峻形势。DNA重组技术的发展，为疫苗技术的突破带来了新的机遇，形成了包括重组亚单位疫苗、活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和转基因植物疫苗在内的一类新型疫苗——基因工程疫苗。其中，活载体疫苗是最具有发展意义的疫苗类型之一。活载体疫苗是将有效的目的抗原的编码基因通过分子生物学手段导入活载体(无或弱毒的细菌或病毒)，构建重组菌(毒)株，使目的基因随着重组菌(毒)株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护应答。活载体疫苗可诱导动物产生体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，具有免疫效果好、成本低、稳定性好、诱导位点专一、免疫方式简单等优点，成为今后疫苗的主要发展方向之一。细菌、病毒等微生物本身能够入侵并启动宿主免疫系统。有研究显示，微生物疫苗载体在肿瘤控制中有良好的靶向性和控制力，甚至发现某些病原微生物偏向于入侵肿瘤组织[1]。不仅如此，微生物载体疫苗在动物疫病与人类复杂疾病方面的研究也成为当前疫苗研究的重要方向。根据已开发的微生物载体类型，可将活载体疫苗分为两类：细菌活载体疫苗与病毒活载体疫苗。现就两种疫苗载体、抗原呈递策略和疫苗免疫效果等予以介绍。

1 细菌活载体疫苗

将病原体的保护性抗原或表位的编码基因插入到细菌基因组或质粒中，并使其顺利表达而获得的重组菌株就是细菌活载体疫苗。根据使用的细菌载体毒性，将细菌载体分为减毒致病菌与非致病菌两类。

1.1 减毒致病菌活载体疫苗

早期应用于疫苗载体的致病菌主要通过化学物质诱变的方法减毒，但是这种减毒方法存在明显的缺陷：如毒力不稳定、减毒具有盲目性和随机性，且可能存在其他未知突变、毒力回复性强等问题[2]，难以达到疫苗安全性的要求。随着分子生物学技术的发展，近年来研究者多采用基因工程技术敲除致病菌毒力基因的方法来构建减毒菌株，敲除毒力基因是一种比常规致弱手段更安全的减毒方法。利用基因工程技术在致病菌染色体基因组上敲除一段或几段基因，以改变其编码毒力因子的基因序列，或改变编码关键代谢途径的酶基因序列，以及插入转座子改变临近基因的功能[3]等均可使其减毒，但仍能使其保留高度的免疫原性。

1.1.1 减毒沙门氏菌活载体疫苗 沙门氏菌(Salmonellaspp.)，属于革兰阴性杆菌，目前应用于疫苗载体的沙门氏菌主要是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。通过基因工程技术，敲除aro、cya/crp、dam、phoP/phoQ、asd等毒力基因，均可得到沙门氏菌的减毒株。减毒后的沙门氏菌仍然具有良好的侵袭力，其入侵机制有入侵黏膜上皮微皱褶细胞(M细胞)或树突细胞(Dendritic Cell, DC)摄取两种途径。M细胞可将抗原物质转运到诱导位点，从而产生由淋巴细胞介导的初级免疫应答。减毒沙门氏菌由M细胞转运到肠黏膜相关淋巴组织(Gut-Associated Lymphoid Tissue, GALT)，激活Th2细胞产生IL-5，活化B细胞分化为浆细胞，使其产生分泌型IgA(SIgA)，SIgA在黏膜免疫中起重要作用[4]。DC作为抗原递呈细胞，在启动获得性免疫中起重要作用，能够加工沙门氏菌并递呈源自沙门氏菌编码抗原的短肽并与其表达的MHCⅡ类产物结合，进而结合并刺激CD4+和CD8+T细胞产生细胞和体液免疫[5]。减毒沙门氏菌载体疫苗免疫简单易行，可采用口服或滴鼻等非注射方式，不但能够诱导目标抗原的免疫应答，同时减毒的沙门氏菌也能诱导相应的免疫应答，可用于生产多价疫苗，应用前景广阔。

近年来，基于沙门氏菌的活载体疫苗的应用已经很广泛。①针对病毒靶标方面，Cong等[6]选用减毒沙门氏菌C500株作为载体构建了携带重组质粒p3D-NT56/S的重组疫苗，该质粒插入口蹄疫抗原基因3D基因，将该重组疫苗进行动物免疫实验起到了很好的免疫效果；②针对细菌靶标方面，Wang等[7]将表达结核杆菌抗原基因Ag85B、ESAT6-Ag85B的重组质粒pV-85B、pV-E6-85B电转化到减毒沙门氏菌株aroA SL7207中构建减毒重组菌株SL(85B)与SL(E6-85B)，诱导小鼠产生高效免疫应答；③针对寄生虫靶标方面，Qu等[8]将编码鼠弓形虫的表面抗原蛋白SAG1的真核表达质粒转入减毒沙门氏菌株ZJ111中，接种小鼠后成功诱导Th1型免疫应答；④针对肿瘤方面，Manuel等[9]构建的导入CO-SVN基因的重组沙门氏菌3342Max能正常表达SVN蛋白以减慢鼠类黑素瘤的生长速度。

1.1.2 减毒单核细胞增生李斯特氏菌活载体疫苗 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogen-es,Lm)是一种革兰阳性菌，具有典型的胞内寄生和胞间传递等特性。Lm的毒力基因主要由prfA、plcA、plcB、hly、mpl、actA等组成，通过敲除以上毒力基因，研究者已构建了大量的缺失突变株，但一些突变株的毒力降低效果并不显著[10]。毒力基因双重敲除的方式能够更好地确保疫苗的安全性，如Brockstedt等[11]构建的actA/inIB毒力基因双重敲除的突变株在保持原有免疫原性的前提下毒性减弱了1 000倍以上。Lm经减毒后作为疫苗载体，能够引起MHCⅠ抗原呈递系统，刺激CD8+和CD4+T细胞产生相应的细胞免疫，且主要是特异性激发CD8+T细胞[12]。Lm作为口服疫苗载体，可产生相应的黏膜免疫，能穿过肠道屏障进入血液循环远程呈递抗原[13]，成为口服疫苗研发的最佳选择之一。

目前，以减毒Lm作为活载体的疫苗研究主要集中于抗病毒、抗肿瘤领域，如人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)、转移性胰腺癌等[14-15]。Maciag等[16]构建的以减毒Lm为活载体的疫苗菌株Lm-LLO-E7已成功应用于治疗晚期宫颈癌的临床实验中。

使用减毒致病菌作为疫苗载体已成为当今疫苗研究的一大热点。迄今为止，已开发的可作为疫苗载体的细菌除上述外，还有其他一些减毒致病菌也应用到疫苗载体的研究中：如Ruan等[17]以大肠埃希菌为载体构建了表达融合抗原1FaeG-FedF-LT192A2：5LTB的重组菌株，口服免疫仔猪产生了相应的特异性免疫应答；Hiroi等[18]以减毒牛型分枝杆菌作为疫苗载体构建的重组卡介苗rBCG-V3J1，成功表达了针对艾滋病的保护性抗原V3；Brzu等[19]以减毒志贺氏菌CVD1203作为载体成功表达了大肠埃希菌热不稳定毒素的B亚单位(LT-B)及肠毒素大肠埃希菌的定殖因子抗原CFA/1和CS3。随着生物信息学与基因工程技术的发展，将会有更多的减毒致病菌种应用到疫苗载体的研究中去。

1.2 非致病菌活载体疫苗

随着减毒致病菌活载体疫苗研究的深入，其缺点也逐渐显现，比如保留的侵袭性和毒性会使其在免疫缺陷者与儿童的免疫应用中受到限制[20]。众多研究表明，尽管使用的致病菌载体是经过减毒的，但其仍保留微弱的毒性，而且还存在着毒力返强的突变风险。此外，革兰阴性菌分泌的脂多糖可能会对宿主细胞有毒性，还可能干扰编码基因在宿主细胞内的转录与表达[21]。因此，非致病菌相较于致病菌在用作疫苗载体时有其独特的优势。

乳酸菌(Lacticacidbacteria, LAB)属于革兰阳性菌，是存在于人类与动物肠道中被认定为安全级(Generally Regarded As Safe, GRAS)的有益菌；一些乳酸菌还具有免疫修饰作用，可以作为激活宿主免疫系统的佐剂，调节机体的免疫水平和提高抗原的免疫原性[22]；以乳酸菌为载体的疫苗生产工艺简单，可以通过滴鼻或口服等非注射方式免疫，使用方便。这些优势使乳酸菌成为疫苗载体的更好选择。乳酸菌表达外源抗原主要有细胞内表达、细胞外分泌、细胞壁锚定三种方式。研究比较以上三种方式并评估其免疫效果发现，用细胞壁锚定将抗原暴露在宿主细胞表面能够获得最为强烈的免疫应答[20,23]。目前，乳酸菌作为疫苗载体已成功表达了禽流感H5N1亚型病毒[24]、肠毒性大肠埃希菌[25]、利什曼虫[26]等的保护性抗原，在对预防与治疗由病毒、细菌及寄生虫引起的疾病方面具有良好的研究价值。此外，乳酸菌还是在黏膜水平上传递细胞因子的理想载体，使用乳酸菌在黏膜水平传递动物细胞因子的研究已经非常广泛，如Bermúdezhumarán等[27]构建的表达IL-10细胞因子的重组乳酸菌能够预防或减轻人类结肠炎疾病，并且该重组菌株作为免疫制剂已经通过了一期临床实验。

2 病毒活载体疫苗

病毒活载体疫苗，是指将外源抗原的编码基因插入到弱毒力的病毒载体基因组的非必需区中并使之顺利表达而获得的重组病毒。目前已用作疫苗载体的病毒种类范围非常广泛，从DNA病毒如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒[28-30]到RNA病毒如新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒[31-33]等。通过缺失、突变病毒的非必需区基因或直接在病毒的基因组内插入能使病毒减毒的基因的方法都可以使病毒的毒力减小，但同时又不会影响其自身的免疫原性和繁殖特性，从而使其具有一定的可作为疫苗载体的安全性。此外，虽然有些病毒本身不能在哺乳动物细胞中复制，但能感染哺乳动物细胞并表达外源抗原，将抗原提呈给宿主免疫系统，引起相应的免疫应答，如禽痘病毒及金丝雀痘病毒等[34]。一般DNA病毒的基因组容量都较大，非必需区基因组有较多的可插入外源基因的位点。作为疫苗的重组DNA病毒的构建一般采用同源重组的方法：将携带外源基因的转移载体质粒与全病毒DNA共转染细胞，通过基因重组将外源基因导入病毒基因组的特定部分，如Han等[35]将PRV Bartha-K61株基因组DNA与构建的质粒pUL21-SRV9G-EGFP进行了同源重组。而RNA病毒的基因组都较小，对外源基因的容量也很小。构建RNA病毒载体要先将病毒RNA基因组反转录成cDNA分子，将cDNA分子插入外源基因后克隆到质粒中，在合适的启动子控制下转录成RNA分子，然后转录的RNA分子转染细胞即可得到重组RNA病毒载体疫苗，如以脊髓灰质炎病毒为载体的艾滋病疫苗[36]，以新城疫病毒为载体表达鸡传染性喉气管炎病毒的糖蛋白gD的禽类疫苗[37]等。

目前，病毒活载体疫苗的研究已经广泛地涉及渔业、畜牧业的各种动物疫病及人类的复杂疾病中，但由于其安全性还未得到长期可靠的验证，距离临床应用还有一定的距离。以痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等为载体的疫苗还能够通过黏膜途径引发黏膜免疫应答，显示出巨大的应用潜力。

3 活载体疫苗抗原呈递策略

对于活载体疫苗而言，寻找合适的载体很重要。合适的载体能够稳定地表达外源抗原并将其呈递到恰当的部位，刺激机体免疫系统产生相应的免疫反应。此外，不同的抗原呈递策略也会影响到疫苗的免疫效果与安全性。活载体疫苗常用的抗原呈递策略有载体-宿主平衡致死系统(vector-host balanced lethal system)、微生物表面展示系统等。

3.1 载体-宿主平衡致死系统

在构建表达外源保护性抗原的减毒微生物载体时，通常将编码外源抗原的基因片段克隆在含抗药基因的载体上，以抗生素作为标记来维持质粒的稳定性。但是，抗原表达系统中存在的抗生素残留会导致抗生素污染等安全性问题，还会引起质粒丢失造成免疫效果下降[38-39]。所以美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，并且在人和动物体内，无法用抗生素来维持重组质粒的稳定性。载体-宿主平衡致死系统的构建避免了抗生素带来的负面问题。

构建载体-宿主平衡致死系统，首先要使宿主菌株缺失编码对菌株生长繁殖所必需产物的管家基因，管家基因的缺失会导致细菌不能合成某种必需的营养物质而死亡，该营养缺陷型的菌株必须在添加相应营养物质的培养基上生长。导入带有其互补基因的质粒与基因缺失菌株构成平衡致死系统后，才能在基本培养基上生长。该系统以营养选择标志代替抗生素抗性标志，使外源基因在宿主菌内稳定表达，有效地解决了减毒活载体疫苗使用中的抗生素污染问题。管家基因一般为编码芳香族氨基酸、胸腺嘧啶、二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)等营养物质的基因片段，用于营养缺陷型菌株的构建。如asd基因编码天门冬氨酸-β-半醛脱氢酶，该酶在DAP代谢中起重要作用。而DAP是构成革兰阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，缺少DAP将造成细菌的裂解死亡。Yan等[40]使用缺失asdB基因的E.tarda菌株与插入asdB基因的载体质粒构建了平衡致死的重组菌株WED△asdB/pUTta4DGap，用来表达鱼病原体嗜水气单胞菌LSA34的保护性抗原基因gapA34。基于营养缺陷型基因构建的平衡致死系统已被证明是替代抗生素的选择标记并增强抗原表达稳定性的有效工具。目前，平衡致死系统已经成功应用于开发沙门氏菌、大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特氏菌、牛分枝杆菌等多价疫苗中[41-44]。

3.2 微生物表面展示系统

外源抗原基因随载体进入宿主体内后的表达量不足严重影响着活载体疫苗的免疫效果。目前普遍认为在微生物载体表面表达外源抗原是活载体疫苗抗原呈递的最佳方式，因此基于锚定重组蛋白到微生物表面的策略得到了越来越多的关注[45]。微生物表面展示系统，就是通过外源抗原蛋白与载体上一定的锚定蛋白融合连接，导入微生物宿主细胞中，从而将外源抗原表达并定位在微生物表面的抗原呈递系统。在疫苗研究领域，应用的微生物表面展示系统主要包括细菌表面展示系统与杆状病毒表面展示系统。

3.2.1 细菌表面展示系统 自噬菌体表面展示技术被开发以来，细菌表面展示技术也得到了飞速发展。细菌表面的锚定蛋白可以是细菌的外膜蛋白、菌毛蛋白与鞭毛蛋白等。外源抗原重组蛋白可以通过跨膜结构域锚定、脂蛋白锚定、基于LPXTG基序的共价连接与基于LysM或Wxl基序的非共价连接方式等与细菌表面蛋白锚定连接，且外源蛋白表达的稳定性和功能性与所采取的锚定方式有关[45-46]。由于革兰阴性菌与革兰阳性菌的结构不同，其作为载体在细菌表面展示系统中的应用也不同。一般认为革兰阴性菌遗传背景清楚，便于构建重组蛋白的表面展示，而革兰阳性菌胞膜外的细胞壁厚而坚韧，膜蛋白难以表露，因此不适合表面呈现。但已有研究成功构建了革兰阳性菌的表面展示系统，如Audouy等[47]以细菌表面展示技术构建的革兰阳性增强基质系统(Gram-positive Enhancer Matrix, GEM)，以乳酸乳球菌为疫苗载体成功表达了肺炎球菌的保护性抗原。目前，细菌表面展示系统已成功地应用于沙门氏菌、枯草芽胞杆菌、嗜水气单胞菌等为载体的疫苗设计中[48-50]，显示出重要的研究价值及广阔的应用前景。同时，细菌表面展示系统仍然存在一些不足：作为表面展示系统的细菌表面展示外源蛋白的能力是有限的，且插入含带电荷残基或疏水残基的氨基酸序列会导致外源蛋白的分泌不足，此外，对于宿主菌遗传背景的有限研究也限制了细菌表面展示技术的发展。

3.2.2 杆状病毒表面展示系统 以细菌为载体的表面展示系统采用的是原核表达系统，此系统缺乏真核生物蛋白折叠的相关因子和酶类，因此难以完成真核生物蛋白的磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、二硫键异构化等翻译后修饰，进而难以递呈复杂的真核生物蛋白，于是像杆状病毒表面展示这样的真核生物表面展示技术显示出更为广阔的应用前景[51]。

杆状病毒表面展示系统是以杆状病毒为载体，将外源抗原基因插入到病毒衣壳蛋白基因或者囊膜蛋白基因，外源蛋白与衣壳蛋白或囊膜蛋白融合表达后经过加工处理，在病毒颗粒表面或感染细胞表面进行展示。在该系统中，杆状病毒表面膜蛋白gp64起着非常重要的作用，外源蛋白融合在gp64蛋白的N端或膜锚定域中，并在gp64蛋白N端的信号肽作用下转运至质膜引起相应的免疫反应[52]。

作为一种真核生物表面展示系统，杆状病毒表面展示系统的构建真正满足了复杂蛋白质的折叠和修饰需求，增加了外源抗原表达的蛋白种类，成为一种新型的用于疫苗载体设计的真核分子生物学工具。目前，在杆状病毒表面展示系统中应用最广泛的病毒载体是苜蓿尺蠖核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒。杆状病毒表面展示系统应用于活载体疫苗的构建已成功表达了鸡传染性支气管炎病毒、甲型流感病毒H5N1亚型、猪瘟病毒、口蹄疫病毒等的保护性抗原[53-56]。

针对不同的外源抗原及宿主细胞特性，寻找其合适的载体与最佳的抗原呈递策略，可能会是今后活载体疫苗发展的主要设计程序之一。如天然的腺病毒突变株Onyx-015可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖，而在正常细胞中无法增殖，将这种突变株载体应用于肿瘤治疗研究中取得了较好的临床效果[57]。像这种条件增殖型的载体给疫苗载体设计提供了新思路、新方法。随着基因工程技术与分子生物学理论的发展，将会有更多的微生物载体及新型的抗原呈递策略应用到活载体疫苗的研发之中。

4 展 望

作为当今基因工程疫苗的热点领域，活载体疫苗生产成本低，能够更加安全稳定地呈递外源抗原，诱导免疫宿主产生多种免疫应答。而且，某些微生物载体本身具有佐剂效果，能够增强疫苗的免疫效应，还可以发展多价疫苗，起到一针防多病的效果，与传统疫苗相比有着无可比拟的优势，在防治动物疫病与人类传染病等复杂疾病方面有着巨大的潜力和广阔的应用前景。尽管很多新型的活载体疫苗已经取得了较好的临床效果，但在将其用作生物制品实现大规模生产方面还存在一些缺陷，如减毒微生物载体对宿主潜在的安全性，活载体受母源抗体的干扰，中和抗体影响免疫效果等。所以，活载体疫苗要应用于实践还要经过更为严格的审批和风险评估。针对减毒微生物载体对宿主潜在的安全性问题，利用不断发展的基因工程技术，在保留其侵袭力的基础上发展更为安全的减毒方法，提升微生物作为疫苗载体的安全性，是疫苗载体安全性研究的一个重要方向。针对不同的外源抗原，选择合适的微生物载体，发展新型的抗原呈递策略，对活载体疫苗的设计非常重要。因此完善对微生物载体的基因组及遗传背景研究，深入抗原呈递机制的研究，能够进一步推进活载体疫苗的发展。而且某些微生物载体携带外源抗原重组蛋白的分泌量不足，难以获得较好的免疫效果，因此研究如何增加外源重组蛋白的分泌量，对活载体疫苗的免疫效果至关重要。另外，为了应对微生物载体对宿主动物造成的炎症等负面效应，一些疫苗的改造修饰技术研究也对活载体疫苗的发展起着举足轻重的作用[58]。

随着生物技术的进步与发展，活载体疫苗因其所具有的特殊优势将得到更加深入的研究和广泛的应用。活载体疫苗的研究将在动物疫病与人类复杂疾病的防治方面发挥巨大的作用，为生物学与医学的发展、人类和动物的健康乃至社会的进步做出更加突出的贡献。