位庚 曹柳 张苏明 侯凤英 赵玉莎 何素彦

[摘要] 目的 探討通心络对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs）损伤的干预作用及其相关机制。 方法 用高糖培养基建立细胞损伤模型，采用随机数字表法将HRCECs分为正常对照组（normal组）、模型组（model组，30 mmol/L葡萄糖）、通心络低剂量组（TXL-L组，100 μg/mL通心络）、通心络中剂量组（TXL-M组，200 μg/mL通心络）、通心络高剂量组（TXL-H组，400 μg/mL通心络）。检测各组细胞生存活性，细胞上清液内皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）和细胞间黏附因子-1（ICAM-1）含量，以及细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和核转录因子-κB（NF-κB）的蛋白表达情况。 结果 与normal组比较，model组细胞生存活性明显降低，细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量升高，细胞eNOS蛋白表达下调，NF-κB蛋白表达上调（P < 0.01）;与model组比较，TXL-M组和TXL-H组细胞上清液ET-1含量明显减少（P < 0.01），TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞上清液IL-6和ICAM-1含量明显减少，eNOS蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达下调（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 通心络可明显改善高糖诱导的HRCECs损伤，并通过减轻炎症损伤发挥细胞保护作用。

[关键词] 通心络;人视网膜微血管内皮细胞;高糖;炎症

[中图分类号] R774;R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2018）12（c）-0012-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effects and related mechanism of Tongxinluo on high glucose-induced human retinal capillary endothelial cells （HRCECs） injury. Methods The cells damaged model was established with high glucose. The HRCECs were divided into normal group， model group （30 mmol/L glucose）， Tongxinluo low dose group （TXL-L group， 100 μg/mL Tongxinluo）， Tongxinluo middle dose group （TXL-M group， 200 μg/mL Tongxinluo） and TXL high dose group （TXL-H group， 400 μg/mL Tongxinluo） by random number table method. The cell viability， contents of endothelin （ET）-1， interleukin （IL）-6 and intercellular adhesion molecule （ICAM）-1 in supernatant， and the endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and nuclear factor （NF）-κB protein expression in cells of each group were detected. Results Compared with normal group， the cell viability was significantly decreased， the contents of ET-1， IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly increased， the protein expression of eNOS was significantly down-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly up-regulated in model group （P < 0.01）. Compared with model group， the contents of ET-1 in supernatant were significantly decreased in TXL-M group and TXL-H group （P < 0.01）， and the contents of IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly decreased， the protein expression of eNOS was significantly up-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly down-regulated in TXL-L group， TXL-M group and TXL-H group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Tongxinluo can signifcantly improve high glucose-induced HRCECs injury， and plays a role in cell protection through reducing inflammatory injury.

[Key words] Tongxinluo; Human retinal capillary endothelial cells; High glucose; Inflammation

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）为糖尿病最为严重的微血管并发症之一，已成为成年人致盲的主要原因，并且发病率还在逐年增加。高血糖被认为是导致DR的重要因素，持续高血糖诱发的视网膜组织中微血管内皮细胞损伤是DR出现血管病理改变的始动因素[1]。中药复方制剂通心络胶囊，在中医络病理论指导下研制而成，对微血管有较好的保护作用[2-4]。已有临床研究显示，通心络对DR有较好的治疗作用[5-6]，但其对视网膜微血管的作用机制尚不十分清楚。本研究选用人视网膜微血管内皮细胞（human retinal capillary endothelial cells，HRCECs）为研究对象，高糖诱导HRCECs损伤，模拟人体内高糖环境对视网膜微血管的影响，观察通心络对该损伤的干预作用及其作用机制，为通心络应用于DR的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验用细胞

HRCECs购自美国ScienCell公司。

1.2 药物及试剂

通心络药粉由石家庄以岭药业股份有限公司提供（批号：S-130901）;内皮细胞培养基（endothelial cell medium，ECM）（美国ScienCell公司，批号：1001）;CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所，批号：KN868）;内皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）及细胞间黏附分子-1（ICAM-1）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20160804、20150916、20160808）;内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体及核转录因子-κB（NF-κB）p65抗体（美国Abcam公司，批号分别为ab76198、ab16502）。

1.3 主要仪器

Effendrof Centrifuge 5804R离心机（德国Effendrof公司）;YP502N电子天平（上海菁海仪器有限公司，读数精度：0.01 g）;多功能酶标仪（美国Bio Tek公司）;UVP凝胶扫描系统（美国UVP公司）;电转膜仪、半干转膜仪、垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 药物配制

1.5 细胞分组及处理

采用随机数字表法将细胞分为以下五组（每组平行设置3～4个复孔）：①正常对照组（normal组），正常培养;②模型组（model组），含30 mmol/L葡萄糖的ECM无血清培养基培养;③通心络低剂量组（TXL-L组），含通心络100 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h后，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络100 μg/mL的无血清ECM培养基;④通心络中剂量组（TXL-M组），含通心络200 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h后，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络200 μg/mL的无血清ECM培养基;⑤通心络高剂量组（TXL-H组），含通心络400 μg/mL的无血清ECM培养基预孵育4 h，换为含葡萄糖30 mmol/L加通心络400 μg/mL的无血清ECM培养基。以上五组细胞处理完毕后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h后进行指标检测。

1.6 CCK-8法檢测HRCECs生存活性

接种于96孔细胞培养板的HRCECs按照“1.5”项处理后，吸弃原培养基，每孔加入含CCK-8的无血清ECM培养基100 μL，放入细胞培养箱中继续孵育1 h后，酶标仪检测450 nm波长处OD值[8]。以各组OD值与normal组的比值行统计分析。

1.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测HRCECs上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量

接种于96孔细胞培养板的HRCECs按“1.5”项处理后，收集各组细胞上清液，1.5 mL无菌EP管中1000 r/min（r = 8.7 cm）离心2 min取上清液。ELISA法检测各组细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1的含量，实验中操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 Western blot法检测eNOS和NF-κB蛋白表达

接种于直径为6 cm细胞皿的HRCECs按“1.5”项处理后，培养皿内加入40 μL细胞裂解液于冰上充分裂解，超声破碎后放入离心机内离心，收集上清液，蛋白定量后取等量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，封闭液中封闭，一抗孵育，二抗孵育，以GAPDH作为内参，将各目的蛋白吸光度值与GAPDH吸光度值的比值进行统计学分析。

1.9 统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时，采用最小显著差法（LSD），若方差不齐，采用Dunnett′s T3法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人视网膜微血管内皮细胞生存活性和细胞上清液中ET-1、IL-6、ICAM-1含量比较

与normal组比较，model组细胞生存活性明显降低，细胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量明显升高（P < 0.01）;与model组比较，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞生存活性明显升高，细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显降低，TXL-M组和TXL-H组细胞上清液中ET-1含量明显降低（P < 0.01）。见表1。

2.2 各组人视网膜微血管内皮细胞eNOS和NF-κB蛋白表达比较

与normal组比较，model组细胞eNOS蛋白表达明显下调，NF-κB蛋白表达明显上调（P < 0.01）;与model组比较，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组细胞eNOS蛋白表达上调，NF-κB蛋白表达明显下调（P < 0.05或P < 0.01）。见表2、图1。

3 讨论

DR是糖尿病最常见和严重的微血管并发症之一，其基本的病理改变为微血管内皮细胞损伤、基底膜增厚、内皮细胞增生、新生血管形成等[9]，后期可形成微血栓甚至引起微血管闭塞[10]。这些微血管的病变属于中医“络病”理论研究的范畴，治疗上应以化瘀通络为主，通心络是在中医络病理论指导下组方而成，由人参、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、赤芍、酸枣仁等药物组成，具有化瘀通络、益气活血等功效。实验证实，通心络具有降脂、抗炎、保护血管内皮细胞、抑制内皮细胞凋亡等作用[11-12]。已有动物实验证实，通心络对KK/Upj-Ay小鼠视网膜组织具有保护作用[13]，亦有临床试验表明通心络治疗DR效果确切。

本研究选用高糖诱导HRCECs损伤作为研究糖尿病视网膜微血管病变的模型，高糖能降低HRCECs的生存活性，TXL-L组、TXL-M组和TXL-H组均能升高HRCECs的生存活性，生存活性的提高是保证血管内皮细胞发挥正常功能的基础条件，说明通心络对糖尿病视网膜微血管病变具有一定的防治作用。一氧化氮（NO）对血管有保护作用，参与维持血管的正常张力，为内皮细胞合成的主要舒血管物质，它的前体是L-精氨酸，由一氧化氮合酶（NOS）催化合成，内皮细胞中存在的是eNOS，由于NO具有不稳定性，故本研究检测eNOS的蛋白表达以间接反映NO的含量。ET-1主要由内皮细胞合成和释放，具有收缩血管的作用[14]。在生理状态下，NO和ET-1的含量在局部保持动态平衡。本研究发现高糖诱导HRCECs后，细胞上清液中ET-1含量明显升高，细胞eNOS蛋白表达明显下调，说明NO和ET-1之间的平衡状态被打破，内皮细胞功能受到了损伤，通心络不同剂量干预后，细胞上清液中ET-1含量明显降低，细胞eNOS蛋白表达明显上调，且呈现剂量依赖性，提示通心络对HRCECs的分泌功能起到了保护作用。

DR的发生机制与持续性高血糖、炎性反应、氧化应激、血管内皮细胞凋亡等因素相关，近年来研究发现，炎症在DR的发生发展过程中起到了重要的作用，该观点的提出为治疗DR提供了新方向[15]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β和ICAM-1等多种炎症因子之间的相互作用影响了DR的发展。IL-6作为前炎症因子，在炎性反应中起着重要的作用[16]，ICAM-1是主要的黏附分子，在血管内皮细胞损伤过程中可释放自由基、细胞因子，亦有研究显示内皮细胞的损伤或死亡部分继发于ICAM-1介导白细胞黏附于视网膜血管。NF-κB是细胞内调节炎症信号转导的关键因子之一，能够调控包括IL-6和ICAM-1在内的多种炎性细胞因子的基因转录表达[17]。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-κB可上调黏附分子的表达，使白细胞瘀滞、黏附于视网膜血管，引起一系列视网膜病变。本研究中，model组细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显升高，细胞NF-κB蛋白表达明显上调，通心络不同剂量干预后，细胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明显降低，细胞NF-κB蛋白表达明显下调。提示通心络能够抑制高糖诱导HRCECs损伤炎性因子的高表达可能是通过抑制NF-κB途径实现的。

高效液相色谱和气相色谱的指纹图谱技术已经证实，通心络胶囊的主要成分为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、芍药苷、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B等。有研究表明，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对内皮细胞具有显著的保护作用[18-19]，而芍药苷可减轻内皮细胞的炎性反应[20]。所以本研究推测，通心络对HRCECs的功能受损和炎性反应的保护作用与此相关，但通心络中是何成分起主要作用还需进一步研究。

综上所述，高糖可诱导HRCECs发生功能障碍及炎性反应，通心络可抑制该过程，其作用机制可能与通心络抑制NF-κB介导的炎性反应有关。

[参考文献]

[1]  Hammes HP. Pericytes and the pathogenesis of diabetic retinopathy . Horm Metab Res，2005，37 Suppl 1：39-43.

[2]  位庚，李红蓉，刘红利，等.通心絡对大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响.中国中西医结合杂志，2016，36：709-717.

[3]  Cui H，Li N，Li X，et al. Tongxinluo modulates cytokine secretion by cardiac microvascular endothelial cells in ischemia/reperfusion injury . Am J Transl Res，2016，8：4370-4381.

[4]  位庚，常丽萍，尹玉洁，等.通心络干预心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的保护作用.中国中西医结合杂志，2017，37（11）：1334-1338.

[5]  朱丹，郗丹，李丹梅，等.通心络治疗2型糖尿病视网膜病变患者临床疗效观察//首届国际络病学大会论文集，2005.

[6]  孟宪民，张书申，段永畅.通心络胶囊联合激光治疗糖尿病性视网膜病变的观察.医学论坛杂志，2011，32：155-156.

[7]  庞洁，梁俊清，王志鑫，等.津力达联合通心络对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞损伤干预作用及机制研究[J].中国药理学通报，2015，31：430-435.

[8]  曹娜，葛力萁，程明月，等.阿托伐他汀通过SIRT1/NADPH氧化酶对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化损伤作用[J].中国循环杂志，2014，29：1000-1004.

[9]  Scanlon Peter H. Diabetic retinopathy . Medicine，2010， 38：656-660.

[10]  赵凌军.中西医结合治疗糖尿病视网膜病变的临床效果分析.中国实用医药，2014，9：165-166.

[11]  Chen L，Wang X，Chen X，et al. Tongxinluo attenuates neuronal loss and enhances neurogenesis and angiogenesis in the ipsilateral thalamus and improves neurological outcome after focal cortical infarction in hypertensive rats . Restor Neurol Neuros，2014，32：533-546.

[12]  Ma L，Liu X，Lu H，et al. Traditional Chinese medication Tongxinluo inhibits inflammatory angiogenesis via Bmx/NF-κB/MAPK pathways . Eur Heart J Suppl，2015，17Suppl ：B13-B22.

[13]  邢邯英，王超，张会欣，等.通心络抑制KK/Upj-Ay小鼠视网膜组织HIF-1a/VEGF/VEGFR-2表达[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（21）：97-101.

[14]  Levin ER. Endothelins as cardiovascular peptides. Am J Nephrol，1996，16：246-251.

[15]  张文博，聂红平.糖尿病视网膜病变与炎症研究进展.中国糖尿病杂志，2016，24：475-479.

[16]  Kaplanski G，Marin V，Montero-Julian F，et al. IL-6：a regulator of the transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation. Trends Immunol，2003，24：25-29.

[17]  Gutierrez SH，Kuri MR，del Castillo ER. Cardiac role of the transcription factor NF-kappaB . Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2008，8：153-160.

[18]  李紅蓉，孙颖，位庚，等.通络药物对血管内皮细胞与单核细胞黏附作用的影响.中国循环杂志，2016，31：480-483.

[19]  张庆勇，朱武飞，罗春华，等.人参皂苷Rg1促血管再生作用的研究进展.广东医学，2015，36：1299-1300.

[20]  马淑慧，王海芳，刘金连，等.芍药苷对TNF-α诱导的内皮细胞TNFR1/NF-κB信号通路的抑制作用.中国中西医结合杂志，2016，36：339-344.

（收稿日期：2018-02-02  本文编辑：张瑜杰）