白俊峰 （北京市第十二中学 北京 100071）

进行植物组织培养时，激素的种类与浓度对外植体形成愈伤组织和芽的诱导效果不同。正交实验设计是研究多因素、 多水平筛选的一种设计方法之一，它是根据正交性从全面实验中挑选部分有代表性的点进行实验，这些点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交实验是一种高效、快速、经济的实验设计方法，可用较少的实验，找到最优组合和趋势最优组合。以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）花序轴（图1）为外植体，选取3 种常用的激素，它们分别是6-苄基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（ NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）； 每种激素选取3 个浓度，其中1 水平为0浓度，2 水平为非洲菊的最适浓度，3 水平为非洲菊的最适浓度加倍（表1）。将三因素三水平正交表应用到地被菊花序轴的不同激素浓度组合筛选中，具体实验设计如表2。

表1 激素种类浓度表

表2 三因素三水平正交实验设计表

1 材料与试剂

1）材料：地被菊幼花序，三角瓶，烧杯，酒精灯，剪刀等。

2）试剂：6-苄基嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），70%乙醇，2%次氯酸钠。

3）仪器设备：超净工作台，光照培养架，高压灭菌锅，鼓风干燥箱。

2 过程与方法

2.1 准备工作

1）消毒剂的配制。按比例配制2%次氯酸钠和70%乙醇。

2）激素母液的配制。分别配制1 mg/L 的6-苄基嘌呤（6-BA）母液，1 mg/L 的萘乙酸（ NAA）母液，1 mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）母液。

3）MS 培养基的配制与灭菌。按照说明配制MS 培养基，并按照三因素三水平正交试验表添加激素，做好标记；118°C 高压灭菌18 min，备用。

4）器械包装和灭菌。将要使用的器械用牛皮纸包裹，165°C 干热灭菌2 h，备用。

2.2 外植体消毒和接种 将地被菊幼花序用流水冲洗20 min，再用70%的乙醇处理后，于超净工作台内用无菌的镊子剥离花序，取出花序轴（图1），置于无菌锥形瓶内，先用70%的乙醇消毒30 s 后，用无菌水冲洗4 次，再用2%次氯酸钠灭菌10 min，用无菌水冲洗4 次，备用；将已灭菌的花序轴置于无菌培养皿内，吸干水分，用无菌镊子和解剖刀切十字花，均分成4 份，接种至培养基内。每瓶接种1个花序轴，每种培养基做6 个重复。

2.3 培养 将接种好的培养基置于无菌室内，（20±2）°C 的条件下，每日光照12 h，连续培养。初始日期为2016年7月13日。

2.4 观察记录 定期观察并记录，按照标准进行排序，根据愈伤的有无、愈伤的大小及高矮、愈伤的颜色对愈伤进行排序和打分。愈伤的打分标准为：愈伤无为0 分，有愈伤的，按照愈伤的大小、高矮、愈伤的颜色进行排序，排第一的为20 分，按照顺序递减2 分，分别为18、16、14、12、10、8、6、4、2；按照芽的有和无打分，无芽0 分，有芽的按照芽的高矮，芽的壮和弱，芽的多少进行排序和打分，排序后，排第一的为20 分，按照顺序递减2分，分别为18、16、14、12、10、8、6、4、2，若在同一水平，无法区分则得分相同，下一排序分数减4分，同时拍照。具体得分和分析见表3～表5，原始图片见图2、图3。

3 结果与讨论

3.1 实验最优组合 实验组内得分最高的组合为实验最优组合。

3.1.1 愈伤的实验最优组合 地被菊花序轴在接种后第18 天的时候，即7月31日可观察到愈伤的组数为5、6、7、8、9 组，愈伤得分排序为6＞5＞8＞9＞7，在生长1 周后,除了对照组没有分化出愈伤,其他组都分化出了愈伤, 愈伤得分排序为8＞6＞9＞7=4＞5＞3＞2，其中8 组优势明显（图2），称之为试验最优组合（表3），8 组的激素浓度组合为A3B2C1，6-苄基嘌呤（6-BA）为3mg/L，萘乙酸（NAA）为0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表3 花序轴原始得分记录

3.1.2 芽的实验最优组合 地被菊花序轴在接种第32 天时，即8月14日只有6 组和8 组有了芽的分化，6＞8，6 组称之为芽的试验最优组合（表5，图3）。6 组的激素浓度组合A2B3C1，6-苄基嘌呤（6-BA）为1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

3.2 趋势最优组合 每个单因素选项加分和最高的组合为趋势最优组合。

3.2.1 愈伤的趋势最优组合 表4为8月7日的愈伤分化情况，利用直观分析的方法，根据数据分析，愈伤的趋势最优组合为A3B3C1，6-苄基嘌呤（6-BA）为3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。

表4 直观分析地被菊花序轴第25 天愈伤

3.2.2 芽的趋势最优组合 利用直观分析的方法,从表5看到8月14日的芽分化表，芽的趋势最优组合是A2B3C1，6-苄基嘌呤（6-BA）为1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L，芽的试验最优组合与趋势最优组合吻合。

表5 直观分析地被菊花序轴第32 天芽

3.3 芽的诱导

1）直接诱芽，可选择6 组培养基，直接培养45 d 即可诱导出芽，再用生根培养基，诱导出根就可炼苗和栽培，这有利于节约生长时间和生长空间，降低育苗成本，有一定商业价值。

2）观察完整的组织培养的过程,可将8 组的愈伤培养至第18 d 时,转至诱芽培养基上进行芽的诱导,待芽长成一定大小,转至生根培养基上进行根的诱导,再依次进行炼苗和栽培。

3.4 结论 愈伤组织诱导的激素浓度最优组合为6-苄基嘌呤（6-BA）为3 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽诱导的激素浓度组合为6-苄基嘌呤（6-BA）为1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。愈伤组织的趋势最优组合为6-苄基嘌呤（6-BA）为3.0 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L；芽的趋势最优组合为6-苄基嘌呤（6-BA）为1.5 mg/L，萘乙酸（NAA）为0.4 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0 mg/L。芽的实验最优组合与趋势最优组合吻合。

3.5 进一步实验 由于愈伤组织的实验最优组合与趋势最优组合有一点偏差，需进一步验证趋势最优组合，看是否优于实验最优组合；芽的趋势最优组合与实验最优组合完全吻合，不需要验证。