陈 健 综述 钟士江 审校

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一组病因未明的选择性侵袭脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质椎体细胞及锥体束的一类慢性进行性疾病。ALS分为散发型和家族型，已经发现包括C9ORF72、FUS、Ataxin-2、SMN1/2等基因与ALS的发病存在一定关系，在大多数ALS患者运动神经元或胶质细胞内都可以找到异常蓄积的蛋白，如异常的SOD1、TDP-43蛋白，这种异常的蛋白蓄积可能对ALS发病有重要影响。利鲁唑和依达拉奉是目前被认可治疗ALS患者有效的药物，但仅仅能增加患者几个月的生存期。虽然临床治疗选择有限，不过随着一种叫做基因沉默(Gene silencing)技术的出现，给ALS患者带来了曙光。本文着重探讨针对ALS的基因治疗前景。

1 ALS起病的分子研究

脊髓肌萎缩侧索硬化是一种起病隐袭的神经系统变性疾病，随着病程进展，患者出现不可逆性肌无力和萎缩、延髓麻痹及锥体束症，脑和脊髓运动神经元受损明显，逐渐蔓延至全身肌肉，包括呼吸肌，患者大多在3到5年内进展为呼吸衰竭[1]。

绝大多数ALS患者是病因未明的(散发型)，但有约10%的患者是家族遗传性的，在这部分家族患者中，又有约20%是因为超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)基因突变造成的，这也是第一个被发现的ALS致病基因。虽然目前针对SOD1的研究仍未明确，但目前较为统一的观点是SOD1蛋白的错误折叠和不稳定构象导致的异常SOD1蛋白蓄积在病因中起关键作用。

除此之外其他的常见突变基因也被认为在ALS的发病中具有重要作用，TDP-43本身是一种转录抑制因子，也是第一个被鉴别的在ALS和前额叶痴呆患者细胞质内异常聚集物的主要成分[2]。TDP-43蛋白的异常蓄积在大多数ALS患者运动神经元细胞中可以看到，正常的TDP-43在细胞质内合成，大部分转运入细胞核参与调节转录、选择性剪接、mRNA修饰等作用，异常的细胞质内TDP-43蛋白蓄积却造成了细胞受损、线粒体破坏，有意思的是由编码TDP-43的TARTDP突变导致的异常TDP-43蓄积只占到了3%～6%[3]。另外除了已知的C9ORF72、FUS、Ataxin-2、SMN1/2等基因，目前也有研究发现TBK1、NEK1、PFN1、MATR3、CHCHD10、TUBA4A等基因可能与ALS起病存在关联[4]。

可见细胞内的异常蛋白蓄积都可能与ALS的发生有关，为此利用小分子RNA(siRNA)干扰特定靶mRNA降解(基因沉默技术)，减少异常蛋白产生或者蓄积可能会成为治疗ALS的良策。

2 ALS的基因治疗进展

2.1 基因沉默减少异常SOD1蛋白蓄积 目前研究认为ALS并不是单一基因导致的基因病，已发现大于30余种基因与ALS起病有关。超氧化物歧化酶编码的SOD1蛋白主要阻止过氧化硝酸亚离子的形成，起到抗氧化作用，自从成功制备了ALS病理鼠模型(SOD1-G93A鼠)以来，对SOD1基因的靶向治疗就一直处于研究中。Rakhit、Peters等[5,6]在体内和体外实验中都发现了SOD1变异蛋白的错误折叠和聚集的证据。这提示我们异常的蛋白聚集很可能对ALS发生发展有重要影响，消除变异蛋白或许可以达到治愈ALS的目的。但是常规给药在血脑屏障的阻挡下很难进入中枢神经系统(CNS)，这给常规药物治疗带来了难度。Stoica等[7]利用腺病毒AAV9携带microRNA在CNS中实现了长期广泛的转导，包括神经元和胶质细胞，令人欣喜的是并没有看到明显的病毒神经毒性作用，不仅如此，最重要的是通过治疗将SOD1-G93A鼠的中位生存期延长了50%。

这种治疗与转导病毒的方式、时间及种类有很大关系，不同的转导方法可能导致不同结果。Borel等[8]发现利用鞘内注射重组腺病毒rAAV10携带人造miRNA可以很好地实现整个脊髓上的运动神经元内表达，然而Samaranch等[9]发现利用重组rAAV9病毒载体则主要转导星形细胞。这提示不同的病毒载体对转导的目的细胞不同。另外影响的细胞类型不同，对生存的提升幅度也不同。Dirren等[10]发现通过主要沉默新生G93A鼠运动神经元的突变SOD1时，即使在老鼠终末期神经保护也可以达到83%～92%，而主要抑制星形细胞SOD1则只有54%～62%，但这两者都好于对照组(33%～38%)。除此之外，最近的研究发现利用不同的载体启动子，能实现更特异性的细胞转导，比如Dirren等[11]使用小胶质纤维酸蛋白启动子(gfaABC1D)可以增加对星形细胞的表达，McLean等[12]发现利用人类突触蛋白启动子(hSYN1)的病毒则主要在神经元中转导，这意味着我们可以进一步提高基因沉默技术的靶向性，实现更有效率的定点基因治疗。

除了上述因素外，研究发现注射时间、载体的种类都会对转导效果产生影响。例如以AAV9-CB-GFP注射到P1和P21的G93A-SOD1鼠，三星期后用GFP免疫荧光检查脊髓运动神经元的转导率分别为(62 ± 1)%和(8 ± 1)%，而星形细胞分别为 (34±2)%、 (54±3)%，提示越早注射病毒，对神经元影响越大。研究者还发现AAV9病毒具有持久的CNS转导能力，即使在终末期老鼠的星形细胞内依然发现病毒表达，P1: (42±2)%, P21:(61±2)%，这说明AAV9病毒载体可以持续的在CNS中表达[13]。最近一项反义寡核苷酸沉默(ASOs)SOD1基因的临床Ⅰ期实验已经结束，证明了载体病毒可以很好的被人体耐受，并且在脑脊液和血液中达到了预期的浓度[14]。

虽然前景巨大，但目前将基因沉默技术运用到临床仍然受到了限制，首先SOD1-G93A鼠不能完全代表ALS患者，其次SOD1蛋白蓄积所致的ALS仅占了所有ALS患者的一部分，下一步还需要更多的研究去明确其他的相关基因。

2.2 基因沉默减少异常TDP-43蛋白蓄积 尽管有许多研究已经证明了针对SOD1的抗寡核苷酸和RNAi治疗在啮齿类动物模型的有效性，但是实际上对ALS的研究作用却非常有限，因为SOD1突变在ALS患者发病病因中仅占2%～5%。但是几乎所有的ALS患者体内都可以找到RNA连接蛋白TDP-43在神经细胞内异常聚集[2]，所以针对TDP-43的研究对于未来治疗ALS更有潜力。TDP-43是具有多种功能的核酸结合蛋白，主要负责调控RNA代谢、转录、运输，稳定等一系列作用，在正常细胞核内是必需的，但是在绝大多数ALS患者神经细胞胞质中都可以看到异常泛素化和高磷酸化的TDP-43聚合体，伴随核内正常的TDP-43蛋白减少。

现在已经有不少研究者认为正是异常积聚在细胞质的TDP相关聚合物导致了细胞毒性，而这毒性损伤很可能与ALS发病存在重大联系。异常的TDP-43聚合蛋白不仅是ALS的病理标志，也在约50%的前额叶痴呆(frontal lobe dementia，FTD)患者身上发现了它的存在。令人欣喜的设想是减少异常TDP-43的聚集就有可能治愈ALS。但是最初的研究发现TDP-43对小鼠的生存是不可或缺的，Wu等[15]发现利用基因敲除TDP-43得到的小鼠常在胚胎期就无法存活，不仅如此，Iguchi等[16]还发现丢失TDP-43的老鼠会出现类似ALS患者的运动神经元受损的症状，这提示正常TDP-43在维持运动神经元功能方面至关重要，而且TDP-43正常功能受损可能会导致ALS。有趣的是不仅敲除TDP-43会出现这样的情况，即使增加表达，依然会导致类似ALS的运动神经元受损行为。

TDP-43是细胞赖以生存的必须蛋白，直接敲除TDP-43并不是一种可行的方法。但是Becker等[17]发现另一种蛋白质ataxin-2对TDP-43形成异常聚合物有一定帮助，所以通过减少ataxin-2蛋白来抑制TDP-43的异常聚合或许是一个好途径。Becker利用病毒沉默ALS小鼠ataxin-2基因，特别是将ataxin-2基因降到正常值一半的病鼠生存期较对照组明显延长，并且更值得惊讶的是完全沉默ataxin-2基因的病鼠中位生存期较对照组延长了80%，研究者想利用这个原理利用反义寡核苷酸沉默ataxin-2来造福ALS患者。但是针对已经发病的ALS患者，这一技术还需要在安全、伦理等方面进行探讨。另一方面科学家也发现ataxin-2在2型脊髓小脑共济失调症中也有重要作用，利用ASO沉默ataxin-2不但可以延缓SCA2的发病而且没有引起胶质细胞的活跃，这意味没有引起CNS中的炎性反应，因为小胶质细胞是CNS中的先天性免疫细胞，在几乎所有类型的ALS患者中都会发现小胶质细胞的活化，可见沉默ataxin-2有望成为治疗TDP-43异常的一种可行方法。

另外研究者发现PABPN1与TDP-43有很强的交互作用，PABPN1可以抑制TDP-43的毒性蓄积，也可以促进异常胞质TDP-43溶解及正常核TDP-43的恢复[18]，对治疗TDP-43异常蓄积乃至逆转ALS病情提供了一条新思路。研究者已经发现异常的TDP-43主要在神经细胞线粒体内，并且调控线粒体mRNA表达，特别是线粒体内呼吸复合体Ⅰ子单元ND3和ND6，当沉默异常TDP-43后，可以阻止细胞内线粒体功能紊乱和神经元丢失，该研究也证明了在ALS患者线粒体内TDP-43比健康人体内的明显增多，同时通过阻止TDP-43进入线粒体，取得了惊人的改善，这为以后治疗ALS提供了一种可行的办法，目前该团队正在继续研究阻止TDP-43进入人类神经细胞线粒体的小型蛋白质[19]。

综上，异常的蛋白蓄积涉及氧化应激、mRNA调控、线粒体紊乱等多个方面，对ALS的发生发展有不可忽视的重要作用，尽管其具体机制仍然未明，但是基因沉默技术已经为人类带来了一缕曙光。

2.3 其他 目前已知与ALS相关基因约有30种，其中最常见的是C9ORF72、FUS、SOD1、TARDBP等，但还有很多未知的导致ALS的基因仍然有待探究。C9ORF72就是一个正在深入研究的代表，它是已知的ALS发病相关基因中占比例最多的，在细胞内膜运输、自噬中都发挥作用，研究已经发现减少正常的C9ORF72蛋白也会导致神经毒性作用，这可能与C9ORF72影响自噬有关。C9ORF72的非编码区有一段跨物种高度保守GGGGCC序列，位于人常染色体9P21，研究者发现在11.7%FTD和23.5%FALS中都可以找到这一段六核苷酸序列的大量重复，重复可达数百乃至上千，然而在健康人这一重复仅有2～23。在一项小规模研究的ALS或FTD患者中这一重复为700～1600[20]。已发现在C9ORF72扩增相关的ALS中，C9ORF72会表达两种不同的mRNA，一种称之为“正义”转录，另一种为“反义”转录，并且会产生许多的二肽重复蛋白(DPRs)，这些重复蛋白都有细胞毒性。Kramer等[21]发现了酵母转录因子Spt4(人类中被称为SUPT4H)调控长的重复基因区域的伸长，而不是短的区域伸长，通过减少酵母里Spt4数量，能够减少C9ORF72扩张所导致的三种产物，改善生存状况，同样在ALS患者的细胞，沉默SUPT4H1基因也有类似的结果，这可能为治疗C9ORF72导致的ALS提供了希望。不足的是目前使用的C9ORF72突变小鼠可以表现人类C9ORF72相关的ALS的分子特征，但是并没有表达出相应的运动受损，这对下一步培育更合理的C9ORF72相关ALS模型动物提出了更高的要求。

其他的基因还有如修正基因EPHA4，低剂量的EPHA4可以帮助ALS患者获得更长的生存期，这可能与促进轴突功能增强有关。随着全基因测序技术的成熟，逐渐又发现了TBK1基因突变与ALS的关系，目前认为TBK1可以磷酸化许多自噬相关蛋白如OPTN2及P62，所以TBK1导致的ALS可能与细胞自噬清除异常蛋白相关。

肌萎缩侧索硬化无疑是一种多基因相关疾病，而大多数的基因突变都与产生异常mRNA有关，异常的蛋白可能直接作用C9ORF72，也可能与细胞正常功能受损相关，如SOD1、TDP的突变。总之这种异常蛋白影响了运动神经元功能紊乱或丢失，利用小分子RNA(shRNA)沉默变异蛋白或许是一条明智之举。

3 展 望

过去人们已经对ALS这一不治之症提出了许多治疗手段，但结局多不理想，动物模型上有效的干细胞移植在临床阶段的治疗效果仍有争议，可能与移植的干细胞无法精准到达神经系统有关。将外源性的干细胞准确的移植到运动神经元损伤的区域以及让它们精确地恢复神经传导，在这方面还有待更多的研究。同时未来的干细胞移植不应该仅仅局限于运动神经元，也应该关注胶质细胞的移植[22]。另一方面神经营养因子对促进受损神经细胞的恢复再生也已经证明了其效果，但是在将外源性营养因子(如胰岛素样生长因子)导入CNS中最开始碰到了阻力，后来科学家发现利用AAV病毒载体可以将类胰岛素因子、脑胶质源性营养因子成功的转入中枢神经系统，并且有了好的结果，这暗示着未来的治疗将会与基因技术密不可分。现在还有一种CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9最早是从细菌和古细菌的自我防御外源病毒感染机制中发现的，CRISPR/Cas9可以靶定特异基因，将人工合成的基因精确地在某个区域表达。CRISPR/Cas9作为一种新兴的技术虽然目前发展还有限，但是在未来有着很大的潜力[23]。不过目前针对ALS的基因治疗研究依然有着两个很大的局限：(1)目前所得到的ALS动物模型并不能很好地概括ALS的病理机制及疾病进展，且病因复杂多样，仅仅针对一种基因的动物模型在临床上作用可能有限；(2)随着基因沉默技术的发展，以减少SOD1毒性蛋白的蓄积为目的的RNAi及ASOs体外实验作用明显，但是在体内试验效果甚微，注入RNAi或ASOs在疾病早期效果较好，但临床上大多是已经发病的患者，针对ALS的治疗依然需要更多的研究，未来的治疗可能会是多种方法的综合治疗如基因沉默、干细胞移植、神经营养等联合治疗。