凌利容，谢文辉，李 丹

福建医科大学附属协和医院消化内科，福建 福州 350001

据世界卫生组织统计，目前全球约有4亿HBV慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌[1]。我国为HBV感染高流行区，2006-2010年全国病毒性肝炎血清流行病学调查显示，我国人群HBV感染率为57.6%，HBV携带率为9.75%，约有6.9亿人曾感染过HBV，其中1.2亿人发展为慢性乙型肝炎患者，每年约有35万人死于HBV感染导致的肝硬化和肝癌[2]。由此可见，HBV感染已对人类尤其是我国居民的健康造成巨大的威胁[2]。目前，由HBV基因组编码的各种蛋白的具体致病机制仍是研究热点，其中乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x，HBx)被认为与慢性肝炎和原发性肝癌的发生关系最为密切[1]。线粒体是参与细胞内能量代谢、细胞凋亡、免疫应答及信号转导通路等的重要细胞器,其与氧化应激的相互影响对多种疾病的发生、发展具有重要的作用[3]。既往研究[4-5]表明，HBx可下调线粒体氧化磷酸化的酶，使肝癌细胞线粒体处于敏感状态，进而引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，脂质过氧化氢的产量增加，且过氧化物及自由基的聚集是肿瘤发生的关键因素。由此，我们得知在HBx诱导肝癌发生、发展的过程中，线粒体功能障碍是一个至关重要的病理生理环节。本文就HBx的结构功能及HBx致线粒体功能障碍的可能机制研究进展作一概述。

1 HBx基因结构和功能

HBV是一种小型的部分双链环状嗜肝DNA病毒，其基因组长约3 200 bp,含有4个重叠的开放读码框，分别称为S、C、P和x区。 x区基因是HBV基因组最小的开放读码框，位于13 740～1 838核酸处，全长465 bp。同时，x基因是HBV基因组结构和功能重叠最明显的开放读码框。它包含增强子2(Enh2)、C基因启动子(cp)和直接重复序列DR1、DR2，具有调控S基因和C基因活性的作用[6]。HBx具有广泛的基因转录调节功能，能与宿主细胞的多种蛋白相互作用，通过调节基因表达和细胞蛋白的功能，进一步影响宿主细胞的信号传导、细胞周期、细胞凋亡及细胞癌变等。HBx可以影响转录因子(transcription factor, TF)、TATA结合蛋白(TATA-binding protein, TBP)、cAMP反应元素结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)，可以间接激活转录因子如NF-κB、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)及Pyk2和Src激酶、Ras、Raf，MAPK与信号传导蛋白和转录激活物3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)等信号分子，HBx还可以激活多种启动子和增强子，如损伤DNA结合蛋白1(DNA damage-binding protein 1，DDB1)、早期生长应答元件(Egr)等参与HBV的复制与转录的调节[6]。

2 HBx在线粒体上的定位

2.1HBx大部分定位于线粒体外膜HENKLER等[7]报道HBx在胞核和胞浆均有分布，并与其表达水平有关，x蛋白在低表达的细胞中完全或绝大部分定位于细胞核内，而过量表达时则可分布于胞质中。HBx功能复杂多样，在细胞核内能够发挥转录激活作用，而在胞浆内，能够促进HBV病毒的复制，引起线粒体损伤。近年来众多学者通过免疫荧光显微镜和亚细胞分离技术证实HBx可定位于线粒体[8-10]。TAKADA等[8]在表达HBx的HepG2细胞中发现，HBx可定位于线粒体，同时RAHMANI等[9]进一步研究表明，HBx在胞质中的水平明显高于胞核，且主要分布于线粒体外膜上。此外，CLIPPINGER等[10]在以原代小鼠肝细胞为模型中发现，HBx全部插入到线粒体外膜中，而在HepG2细胞中，HBx部分暴露在线粒体的表面，部分插入到线粒体外膜中。以上这些研究均证实了HBx大部分定位于线粒体外膜。

2.2HBx氨基酸序列中与线粒体定位有关的区域HBx蛋白的氨基酸残基数在145～154，分子量约为17 kDa。其中52～148位的氨基酸是HBx蛋白活性必须的部位，缺失第1～50位氨基酸可以上调它的转录功能。已有的研究[11]发现，HBx中有一段跨膜区域aa54～70与线粒体定位有关且其螺旋区域的aa75～88和aa109～131有助于HBx定位于线粒体。LI等[12]报道，HBx氨基酸序列的C末端是它特异性结合于线粒体的重要区域，该区域由7个氨基酸组成，其中第115位半胱氨酸残基是HBx与线粒体作用的关键氨基酸，当它突变为丙氨酸时，HBx就无法定位于线粒体。

3 HBx致线粒体功能障碍的可能机制

线粒体是调节细胞凋亡、细胞能量代谢及信号传导通路的重要细胞器。在慢性肝炎及肝硬化的发展过程中，线粒体功能障碍是诱发严重肝病的重要环节。目前HBx致线粒体功能障碍的具体机制还未明确。大多数的研究表明，HBx可通过多种途径打破线粒体的动态平衡，诱发肝细胞线粒体功能损伤，主要包括以下3种：(1)HBx可与线粒体相关蛋白相互作用[13-17]；(2)HBx改变Raf-1丝苏氨基酸激酶1(Raf serine/ threonine kinases 1,Raf-1)在细胞内的分布[18]；(3)HBx调控Bcl-2家族蛋白参与线粒体介导的凋亡途径[19]。

3.1HBx与细胞色素c氧化酶Ⅲ(cyto-chromecoxidaseⅢ，COXⅢ) 细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)是线粒体呼吸电子传递链的终端酶，其主要功能是参与线粒体膜两侧的质子传递。COXⅢ是组成COX质子传递通路的主要组成部分，当COXⅢ缺乏时，COX将无法进行质子传递，造成ATP合成障碍继而导致电子和氧分子的累积[20]。李丹等[21-22]通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞cDNA文库中筛选出一种新的x结合蛋白COXⅢ, 并进一步证实了具体结合区域定位于氨基酸72～117。目前已有诸多文献[13,23]报道，HBx与COXⅢ的相互作用是诱发线粒体功能障碍的重要因素。ZOU等[13]通过激光共聚焦显微在稳定表达HBx的HL-7702细胞中发现 HBx能与COXⅢ共定位于线粒体且HBx 能够上调COXⅢ蛋白的表达及COX的活性，导致质子传递功能障碍，多余的质子及电子不断累积，进而减少了ATP的合成，最终造成线粒体跨膜电位改变，内源性ROS水平升高。ZHENG等[23]进一步报道HBx可通过上调ROS水平,增加COX2的表达，进而激活β-catenin信号传导通路促进肝细胞的增殖。近年来关于Wnt/β-catenin通路的研究越来越多，已有研究[24]证实，活化 Wnt/β-catenin通路能够促进肝癌细胞HepG2的生长。此外，过量的ROS、COX2及β-catenin与炎性疾病及癌症的发病机制关系十分密切，特别是局部过高的ROS水平，可通过影响NF-κB、MAPKs及STAT3等信号传导通路激活炎症小体NLRP3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性介子的释放，加速肝细胞的炎症损伤[25-27]。

3.2HBx与线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP) MPTP是一种存在于线粒体内外膜之间的非特异性通道，正常生理情况下，MPTP允许分子量小于1 500的溶质通过，当其受到外界刺激时，MPTP开放，线粒体内膜的完整性受到破坏，引起线粒体基质肿胀及膜电位去极化促使细胞色素c、凋亡诱导因子及钙离子等凋亡因子释放到细胞浆中，通过启动半胱天冬氨酸蛋白酶的级联反应，诱导细胞凋亡或坏死。有研究发现，HBx能够通过调节线粒体MPTP的开放，使大量的钙离子进入胞浆，导致细胞浆钙离子超载，胞浆钙离子超载可以激活一系列蛋白激酶，活化Ras/Raf/MAPK、Pyk2/FAK-Src等信号通路，并使HBV核心蛋白COOH端磷酸化，促进HBV DNA的复制[14-16]。随后GAO等[28]的研究进一步阐明，HBx可调控MPTP使得胞质中钙离子水平升高，并发现使用MPTP抑制剂环孢素A可有效降低细胞内钙离子水平，从而抑制HBV的复制。另外，细胞膜和内质网上的钙离子通道开放也会导致钙超载，且当胞浆内的钙离子浓度升高到一定的水平时，将会进一步刺激MPTP开放，释放细胞色素c及凋亡诱导因子等物质，激活内源性凋亡通路[29]。

3.3HBx与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondriaantiviralsignalingprotein，MAVS) 线粒体是细胞内氧化磷酸化及合成ATP的的最重要场所，除了参与细胞能量代谢外，在宿主细胞抗病毒反应中发挥重要作用，这种抗病毒反应主要依赖于线粒体外膜的一种接头蛋白即MAVS。MAVS是线粒体中发现的第1个与先天性免疫相关的蛋白质，可通过自身的疏水跨膜结构域( transmembrane domain, TM)定位于线粒体外膜和内质网，在病毒感染过程中MAVS可通过激活NF-κB和IRF3信号通路诱导β干扰素的生成，从而发挥抗病毒的作用。有研究[30]报道，在HBV感染过程中，HBx可以与MAVS蛋白相互作用，使MAVS的第136位赖氨酸泛素化，进而抑制MAVS信号通路的IFN-β的生成，减弱固有免疫系统的抗病毒反应。

3.4HBx与线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2，Mfn2) 早期研究[31]发现HBx能够与p53末端形成蛋白质—蛋白质复合体，通过直接或间接作用相互抑制，从而干扰p53对于细胞凋亡、细胞周期、DNA修复和抑制肿瘤生长等正常功能的调控。有研究[32]发现，细胞内一种新的p53结合位点——Mfn2，p53能够与Mfn2的启动子结合，使Mfn2的表达上调。Mfn2是一种潜在的肝细胞癌肿瘤抑癌基因，有研究[33-34]表明，Mfn2有促进肝癌细胞凋亡的作用，且其促凋亡作用可能是通过线粒体凋亡途径介导的。WANG 等[17]研究表明，在HBx转染的肝细胞癌中，当阿霉素或p53质粒存在时，Mfn2的上调被抑制，并且在以阿霉素治疗的HepG2中，Mfn2启动子的活性并未增强，这说明HBx能够有效地干扰p53的作用位点，且这种干扰作用不能被某些化疗药物所恢复。以上的研究结果表明，HBx可以干扰p53对于Mfn2的直接调控，为HBx促癌机制及如何对抗以p53为作用靶点的化疗药物，提供了新的理论参考和依据。

3.5HBx与Raf-1Raf-1是细胞质中一种分子量为 300～500 kDa 的多蛋白复合体，由热休克蛋白90 及二聚蛋白 14-3-3 组成的，它能够定位到线粒体并阻止casepase9的激活，从而保护细胞的调亡[35]。早期有研究[36]发现，在 HBx 诱导的氧化应激可以导致 Raf-1 转位到线粒体，使用免疫共沉淀法证实了HBx 与 Raf-1 形成一个蛋白-蛋白复合物。Raf-1激酶抑制蛋白(Rafkinase inhibitory protein, PKIP)，它可以与 Raf-1 结合，调节多条信号通路，特别是抑制 Ras-Raf-1-MEK1/2-ERK1/2 通路。在 HBx 介导的肝癌形成过程中，RKIP 的表达下调，使 Raf-1 的水平提高，更多的 Raf-1 换位到线粒体，增加抗凋亡的作用，从而导致 HBx 介导的HCC的形成[18]。

3.6HBx与Bcl-2家族蛋白Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的关键调节分子，而线粒体在细胞凋亡过程中扮演重要的角色。近年来，随着研究的不断深入，发现Bcl-2家族蛋白可通过调控线粒体膜的通透性及刺激线粒体释放细胞色素c等参与线粒体介导的内源性凋亡途径，其家族成员在HBx蛋白诱导的线粒体损伤和细胞凋亡的过程中发挥重要作用[19]。根据其结构和功能的不同，Bcl-2家族蛋白可分为3类：(1)含有4个BH区域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W和 Mcl-1等；(2)含有3个BH区域的促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bok；(3)Bcl-2同源结构域(Bcl-2 homology，BH)3个亚家族，包括Bik、B1k、Bad和Bid等[37]。早期的研究[38-39]证实，HBx本身并不影响细胞色素c在细胞内的分布及释放，但在TNF-α的刺激下能够显著下调Bcl-xl的表达水平，且HBx能够促进HepG2细胞对氧化应激的敏感性，引起Mcl-1蛋白缺失进而激活caspase3诱发细胞凋亡。有研究[40]报道，HBx可以直接结合于Bax并促进Bax蛋白向线粒体转位，致线粒体膜电位丢失和细胞色素c释放，从而介导细胞凋亡，使用Bax的抑制剂Bcl-xl，可以抑制Bax的这一作用。此外，HBx蛋白具有BH3(Bcl-2 homology 3)样结构域，能与Bcl-2及Bcl-xl相互作用，弱化Bcl-2的抗凋亡作用，TERRADILLOS等[41]在HBx的转基因小鼠中也发现了同样的现象。所以，Bcl-2家族蛋白在HBx诱导的细胞凋亡中至关重要。

综上所述，HBx是一个多功能调节蛋白，可定位于线粒体并通过多种途径引起肝细胞线粒体的功能障碍。HBx通过与线粒体相关蛋白相互作用、改变Raf-1的分布及调节Bcl-2家族蛋白诱导肝细胞凋亡等都将会影响线粒体的生理功能受损，引起线粒体功能障碍，导致肝细胞出现病理状态，最终促成慢性肝炎及肝癌的发生、发展。HBx改变线粒体结构功能的机制极其错综复杂，仍需进行深入研究。而对这些机制的深入研究将有助于为HBV治疗提供新的药物作用靶点。