吴若菲

摘 要 利用电喷雾电离质谱研究了在气相条件下18冠醚6与20余种天然氨基酸及其异构体间的非共价相互作用。定性结果表明，在气相中18冠6可以与氨基酸形成化学计量比为1∶1的非共价复合物。配制一系列不同浓度的18冠6分别与固定浓度的氨基酸反应，利用质谱测得反应物和产物的质谱峰， 计算冠醚分别与L苯丙氨酸、L酪氨酸、L赖氨酸和L天冬氨酸反应的复合物结合常数lgKa分别为3.90、 3.75、 4.06和3.64， 基于此建立了校准曲线。通过竞争反应实验，以上述4种氨基酸与冠醚复合物的结合常数为参考值，可推算得到其余氨基酸与冠醚的结合常数。实验结果表明，冠醚氨基酸复合物的稳定性与氨基酸的种类相关，节碱性氨基酸以及侧链是烷基（或氢原子）的氨基酸对冠醚的亲和性更好， 而酸性氨基酸（如L丝氨酸）以及侧链上有酰胺键的氨基酸，对冠醚的亲和性较低。 研究了18冠6对L型氨基酸及其D型异构体的手性选择性，结果表明，18冠6只能识别部分中性氨基酸。

关键词 18冠醚6； 氨基酸； 电喷雾电离质谱； 非共价相互作用

1 引 言

1967年，杜邦公司的Pedersen[1，2]在实验室首次合成了一种新的大环聚醚化合物，这类化合物主要由-CH2CH2O-的重复单元组成，由于其形状酷似皇冠，所以被统称为冠醚。典型的冠醚及其衍生物如图1所示，冠醚的命名原则通常采用Pedersen法[1]。例如1，4，7，10，13，16六氧环十八烷C12H24O6（图1a），可称为18冠醚6（简写成18冠6或18c6）。

冠醚外层亲脂而内层亲水，其空腔可由不同的合成方法被调控，因此，它能够选择性地与金属阳离子或其它小分子络合[3，4]。此外，冠醚衍生物还可以手性识别和分离某些对映体化合物[5，6]。如今，冠醚的应用涉及生物化学、能源等多个领域，包括离子选择性电极、离子活化与抑制、色谱手性固定相、大环液晶、相转移催化剂、膜转运离子载体等[7～10]。

近年来，由于冠醚与蛋白质或多肽等生物大分子中的某些氨基酸残基如赖氨酸残基的特异性结合非共价相互作用日益受到人们的关注，这种结合使得冠醚可以作为蛋白质的结构探针，即冠醚具有潜在的分子识别作用[11]。 在进行以非共价方式加合蛋白质的探针实验[12～13]时，冠醚类化合物可与蛋白质上的赖氨酸残基的侧链相结合。Stedwell等[14]通过红外多光子解离技术研究了冠醚与质子化氨基酸形成的复合物，红外光谱图显示NH+3中NH伸缩振动的红移比较明显，表明NH+3与冠醚间的相互作用相当稳定。Chen等[15]通过导向离子束串联质谱（GIBMS）及理论计算，对18冠6与5种氨基酸分别形成的复合物进行研究，发现冠醚与氨基酸的结合常数随其质子亲和性增强而减小。研究冠醚与各种氨基酸间结合作用的强弱，对于冠醚在多肽药物的筛选，以及冠醚在靶向药物方面的应用都具有积极意义。但目前尚未见对冠醚和常见氨基酸的非共价作用進行系统性定性和定量分析的文献报道。

近年来，随着质谱技术迅速发展， 电喷雾质谱已经成为研究非共价复合物一种强有力的工具 [16，17]。本研究在以18冠6为代表，采用电喷雾电离质谱法（ESIMS）研究冠醚对20种L型天然氨基酸的非共价作用，用质谱滴定法定量测定18冠6分别与20种L或D型氨基酸的结合常数，探讨不同氨基酸的氨基端、羧基端和侧链对复合物结合强度的影响，同时用简易的方法探索了18冠6对氨基酸对映体的手性选择性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

电喷雾电离质谱（ESIMS）仪器为API3000型质谱仪（SCIEX公司），质量精度由聚丙二醇（PPG）校准，实验气体均为99.99%的高纯氮气。

18冠6（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；甘氨酸（Glycine，Gly）、L赖氨酸（Lysine，Lys）、L精氨酸（Arginine，Arg）、L组氨酸（Histidine，His）、L丙氨酸（Alanine，Ala）、L苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、L色氨酸（Tryptophan，Trp）、L缬氨酸（Valine，Val）、L亮氨酸（Leucine，Leu）、L异亮氨酸（Isoleucine，Ile）、L脯氨酸（Proline，Pro）、L蛋氨酸（Methionine，Met）、L酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、L丝氨酸（Serine，Ser）、L苏氨酸（Threonine，Thr）、L半胱氨酸（Cysteine，Cys）、L天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、L天冬酰胺（Asparagine，Asn）、L谷氨酸（Glutamic acid，Glu）和L谷氨酰胺（Glutamine，Gln）及它们的D型异构体（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98%）。

2.2 实验方法

ESI正离子模式，电喷雾电压为4.5 kV，进样速率为3 μL/min。实验中，所有溶剂均为甲醇水体系（1∶1，V/V，含有0.1%甲酸），pH=3.6。

3.3 结合常数的计算

将不同浓度的18冠6与LPhe混合，使得混合后18冠6的浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mmol/L，氨基酸的浓度为0.10 mmol/L。由一级质谱图和式（1）、（2）、（3）可以得到表1。

采用同样方法可以得到冠醚分别与LTyr、LLys和LAsp及与其D型异构体间的结合常数（表2）。结合图4可知，定性分析结果与定量计算结果相符。以LAsp、LLys、LPhe和LTyr为第一客体，分别绘制校准曲线（表3）。

LPro与冠醚的结合常数（lgKa=3.17）较低，可能的原因在于N端的刚性结构使其不易与冠醚结合。酸性氨基酸中，LGlu与冠醚的结合常数（lgKa=4.01）大于LAsp（lgKa=3.64），因为LGlu侧链上的羰基离N端氨基较远，吸电子效应更低。在中性氨基酸中，LSer和LThr对冠醚的亲和力也较低，推测是N端氨基上的氮原子与侧链的羟基上的氧原子间形成了分子内氢键[19]、导致质子化的氨基难以进攻冠醚；LAsn或LGln与冠醚的结合常数是20种氨基酸中最低的，可能因为它们的侧链上具有吸电子的酰胺。endprint

此外，测量和计算方法也会对氨基酸跟冠醚的结合常数的大小产生影响。Chen等[15]的实验结果表明，在碱性氨基酸中，LLys对18冠6的亲和性最强，故LLys残基的侧链是冠醚与蛋白质或多肽类物质结合时的有效位点；Gly对冠醚的亲和性最强，即比起氨基酸侧链上的氨基，其N端上的氨基更易与冠醚配位。Chen等[15]认为这是因为18冠6具有三重对称轴（D3d），且空腔尺寸合适，所以形成了3个NH+ O的氢键，而冠醚能使质子化的NH+3稳定存在，即冠醚对NH+3有很好的亲和力。Yu等[20]通过荧光滴定法测得的18冠6与Trp的结合常数（lgKa=2.19）低于本研究测得值（lgKa=4.04）。这是因为ESIMS会加强静电作用，削弱疏水作用，因此通过ESIMS测得的结合常数大于通过荧光法测得值。

总之，因氨基酸侧链上的基团不同，氨基酸对18冠6的亲和性也不同。通常，当氨基酸具有多个NH2基团或不含侧链时，它对冠醚的亲和性会更高。因此，推测NH3+与冠醚的配位方式如图6所示。

4 结 论

本研究利用ESIMS研究了18冠醚6和20种天然氨基酸之间的非共价相互作用。结果表明，18冠醚6与氨基酸能形成化学计量比为1∶1的非共价复合物。冠醚主要通过与氨基酸上的NH2配位而与其结合，故在L型氨基酸中，侧链为烷基（或氢原子）的氨基酸、碱性氨基酸对冠醚的亲和性更强。同时，实验也表明冠醚仅能识别部分中性氨基酸及其异构体。

拟在本研究基础上， 继续研究冠醚与特定的多肽的结合情况，观察是否符合冠醚与氨基酸的结合规律，也可以探索空腔尺寸不同的冠醚或冠醚衍生物与氨基酸极其衍生物的结合情况，以期为冠醚类化合物在生物制药筛选等领域的发展提供参考。

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Abstract The noncovalent interactions between 18crown6 （18c6） and 20 common types of protonated amino acids were explored by electrospray ionization mass spectrometry （ESIMS）. The mass spectra showed the formation of 1∶1 stoichiometric noncovalent complexes between 18c6 and amino acids. The calibration curves and linear equations for the complexes of LPhe， LTyr， LLys and LAsp with 18c6 were established by mass spectrometric titration and used as reference values for competitive ESIMS. Through competitive equilibrium， the binding constants for the complexes of 18c6 with other Lamino acids and their Disomers were derived. It was found， as a general trend， lgKa for the complexes of 18c6 with the basic amino acid and the amino acid with alkyl side chain were larger than other complexes， and among the amino acids with alkyl side chain， Gly and Ala exhibited greater 18c6 binding affinities. As for Ser and Thr， the intramolecular hydrogen bond between the nitrogen atom from terminal NH2 and the oxygen atom from carboxyl may impede their protonated aminogroup to attack the 18c6. Furthermore， Gln and Asn exhibited lower 18c6 binding affinities probably due to effects of electronwithdrawing group of acylamide. Finally， the chiral selectivity of 18c6 for 19 L， or Damino acids was measured by ESIMS， indicating 18c6 could only recognize some neutral amino acid isomers.

Keywords 18Crown6； Amino acid； Electrospray ionization mass spectrometry； Noncovalent binding affinity

（Received 5 May 2017； accepted 20 September 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 2011YQ14015006）.endprint