刘 鹏 ，朱子昭 ，常 柏 ，李巧芬

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津医科大学代谢病医院，天津 300050）

糖尿病在中国的患病率快速增长，成年人患病率已达11.6%，更严重的是中国约有45%的糖尿病患者未被诊断[1]。糖尿病对患者生命及生活质量最大的威胁来自其并发症。长期高血糖可导致大血管及微血管动脉粥样硬化，伴有下肢血管病变的患者如果发生急、慢性损伤出现皮肤破溃，则会引发糖尿病足病，这是糖尿病患者住院率最高的疾病。糖尿病足的主要治疗手段为清创、控制感染、改善局部血液循环，必要时需截肢[2]，糖尿病难愈性溃疡的修复是困扰临床医生乃至整个内分泌界的难题。中国传统医学中具有生肌长皮作用的外用药多种多样，生肌象皮膏是其中代表之一，目前多用于治疗各种感染伤口、慢性溃疡及糖尿病足[3]。本课题组既往的研究已经证明，生肌象皮膏可以加速糖尿病大鼠难治性溃疡创面的愈合；可以增加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、基质金属蛋白酶的含量；增加早期纤维连接蛋白的含量；能增加胰岛素样生长因子-1受体的表达。生肌象皮膏可以在一定程度上抑制终末糖基化产物及受体的产生，随时间的延长，更为明显，促进糖尿病溃疡的愈合[4-7]，对治疗糖尿病难治性溃疡有着良好的临床效果[8]。本实验旨在通过对酪氨酸激酶受体-2（Tie-2），血管紧张素Ⅰ（Ang-1）及血管紧张素Ⅱ（Ang-2）mRNA转录水平的动态观察，进一步揭示生肌象皮膏促进糖尿病溃疡愈合的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SD大鼠，雄性，清洁级，28日龄，体质量（102．83±4．10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。

1.2 实验试剂 生肌象皮膏、凡士林、氯仿、异丙醇、无水乙醇均购自天津中医药大学第一附属医院制剂室；链脲佐菌素（STZ），产自美国Sigma公司；超纯RNA提取试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）试剂盒、5x RNA Loading Buffer，均产自TaKaRa公司。Real-Time PCR检测目的基因引物，见表1。

1.3 实验仪器 罗氏血糖仪及试纸条，产自罗氏诊断产品有限公司；3K30型高速台式冷冻离心机，产自美国Sigma公司；Bio Tek Synergy2多功能酶标仪，产自美国Bio-Te K公司；Bio-Rad电泳仪，产自美国Bio-Rad公司。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 实验方法

2.1 造模及分组 健康SD大鼠120只，均为雄性，在适应性常规饲料喂养1周后按体质量、血糖分层，随机分为2组，分别为空白对照组20只，糖尿病组100只。糖尿病组大鼠采用高脂饲料喂养8周，经尾静脉注射小剂量STZ的方法制备糖尿病模型，剔除糖尿病大鼠造模过程中死亡及未成模的大鼠。1周后经过尾静脉注射苯巴比妥麻醉，在背部后侧用打孔器打直径为2．5 cm的孔，深度伤及筋膜层，并及时止血及无菌纱布包扎，以制备溃疡模型，剔除死亡及未成模大鼠。剩余随机分为：生肌象皮膏组、凡士林组、糖尿病对照组3个糖尿病溃疡模型组，每组各32只。

2.2 给药 造模完成后用单笼饲养每组大鼠，自由饮水，常规饲料进食。每日清晨祛除硬痂，常规消毒，用生理盐水冲洗创面后换药布1次。生肌象皮膏组用生肌象皮膏纱条外敷，凡士林组用凡士林纱条外敷，空白对照组及糖尿病对照组以生理盐水纱条外敷。4组动物创面均外用无菌纱布包扎，固定。

2.3 取材 剔除死亡及未成模大鼠，每组分别于造模成功后 1、3、7、14、21 d 处死部分大鼠，采用股动脉取血及手术取新鲜创面肉芽组织，用液氮分别冷藏各时间点样本，保存备用。造模成功主实验完成各组死亡大鼠数量分别为生肌象皮膏组10只，凡士林组9只，糖尿病对照组10只，故最终纳入生肌象皮膏组22只，凡士林组23只，糖尿病对照组22只。

2.4 检测 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法检测各组溃疡组织中Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA的转录水平。用超纯RNA提取试剂提取组织样本中总RNA，并进行RNA质量检测，核酸在260 nm附近有强吸收，蛋白质在280 nm附近有强吸收，利用此性质使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定RNA的A260/A280的比值，理想的RNA纯度A260/A280应在 1．9～2．1 范围之间。取 5 μL RNA 用 1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用反转录试剂盒中的gDNA Eraser对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理后进行反转录。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，根据Real-Time PCR原始检测结果，按照 2-ΔΔCt相对定量计算公式，即 F=2-{[待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值]}，计算出各样本的目的基因相对定量结果。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18．0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示；组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，P＜0．05为差异统计学意义。

3 实验结果

于造模成功后 1、3、7、14、21 d 提取出的各组糖尿病大鼠溃疡组织中Ang-1、Tie-2 mRNA水平均显著低于空白对照组（P＜0．05），且生肌象皮膏组大鼠溃疡组织中Ang-1、Tie-2 mRNA水平明显高于凡士林组及糖尿病对照组（P＜0．05），结果见表 2、3。各糖尿病模型组中Ang-2 mRNA水平明显高于空白对照组（P＜0．05），且生肌象皮膏组 Ang-2 mRNA水平明显低于糖尿病对照组（P＜0．05），结果见表4。

4 讨论

外伤溃疡属于中医中的疮疡，创面脓液的多少在一定程度上影响了溃疡愈合的速度[9]，此为“偎脓长肉”理论的概要。中医治疗的代表方为出自《疡科纲要》的生肌象皮膏，其组成包括由象皮粉、当归、血余炭、龟板、生地、生炉甘石、生石膏、香油及白蜡。主药为象皮，陈宝元等[10-12]对比含有及不含有象皮的两种生肌膏在抗炎及免疫调节方面的药理作用，考察了象皮在组方中的作用和地位。其研究结果显示，含有象皮的组方与无象皮的组方在临床疗效方面有明显的差别，表明象皮在生肌象皮膏中有其独特的作用和地位。孙玉芝等[13]研究发现，血余炭能较显著增强血小板聚集作用，血余炭粗晶可进促内源性系统凝血，其止血原理与血浆中cAMP含量有关，并能降低血小板内环核苷酸含量，有一定的抗炎、抗菌作用。炉甘石收湿止痒敛疮，可吸收创面分泌物，周灵君等[14]研究发现炉甘石通过改善创面的血液循环、加速创面的新陈代谢、促进伤口成纤维细胞和毛细血管的形成，加快肉芽组织增生等方面的作用，加速皮肤创口的愈合。煅石膏收湿止血、生肌敛疮，李祥等[15]对照煅石膏与生石膏的生肌药效发现，煅石膏治疗组与生石膏治疗组比较，大鼠创口成纤维细胞数、肉芽组织中毛细血管数和肉芽组织中毛细血管面积均显著增加，表明煅石膏能够促进大鼠伤口成纤维细胞和毛细血管的形成，加快肉芽组织增生，从而加速皮肤创口的愈合。再配伍当归、生地、龟板三药濡养受损皮肤，养血生津，生肌长皮。

表2 各组大鼠溃疡肉芽组织中Ang-1 mRNA水平比较(x±s)Tab.2 Comparison of the level of Ang-1 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s)μg/L

表3 各组大鼠溃疡肉芽组织中Ang-2 mRNA水平比较（x±s）Tab.3 Comparison of the level of Ang-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group（x±s） μg/L

表4 各组大鼠溃疡肉芽组织中Tie-2 mRNA水平比较（x±s）Tab.4 Comparison of the level of Tie-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group（x±s） μg/L

在高糖条件下，炎症反应低下且呈阶段性延长、新生血管生长缓慢、基质蛋白水解酶呈高水平状态、胶原合成减少、肉芽组织形成变慢等[16-17]。新生血管网的形成是创面修复的中心环节[18]，只有形成丰富的新生血管网，才能为组织修复提供所必须的氧及其他营养物质，从而促进创面微循环，加速创面愈合。

本次实验的结果与既往研究观点相一致，实验结果提示糖尿病皮肤溃疡愈合困难可能与创面局部Ang-2表达水平持续升高及Ang-1、Tie-2表达水平下降有关。生肌象皮膏可抑制糖尿病创面肉芽组织中Ang-2的表达，可能通过上调创面肉芽组织中Ang-1、Tie-2的表达水平，下调Ang-2的表达水平促进糖尿病溃疡面的愈合。Ang/Tie-2信号通路与血管生成密切相关，其中Ang-1能够促进新生血管内皮细胞存活并维定状态。同时，Ang-2通过介导血管去稳态化，拮抗Ang-1的作用靶点，从而抑制血管生成、成熟与存活[19]。升高的Ang-2一方面导致炎症过程延长，另一方面拮抗Ang-1的作用，导致新生毛细血管成熟障碍、渗透性增加、创面愈合慢。

酪氨酸蛋白激酶受体－2（Tie－2）作为 Ang-1 和Ang-2的共同受体，Ang-1与其结合后，能够促进血管重塑以及新生血管的成熟，并进一步维持血管内皮的完整性[20]。另外，Ang-1/Tie-2还能够通过阻止血管内皮细胞生长因子缺乏而发生的凋亡。在内皮细胞中，Ang-2可竞争性地抑制Ang-1引起的Tie-2磷酸化，抑制血管周围细胞的积聚，并拮抗Ang-1对内皮细胞的趋化作用。本实验发现，生肌象皮膏组Tie-2表达水平升高，提示生肌象皮膏可能通过促进Tie-2的表达、增加Ang-1的受体数量，进而增加创面肉芽组织中新生毛细血管的建立、成熟及稳定，以此保证肉芽组织的血供，促进溃疡面的愈合。

本实验以糖尿病溃疡动物模型为载体，从Ang/Tie-2通路表达促进血管新生角度探讨生肌象皮膏促进糖尿病溃疡愈合的可能作用机制，同时也为中医“偎脓长肉”理论提供科学依据。

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