孙甫+杨姣+吴文焕+王磊+田宇

摘 要：转基因动物是应用实验的方法将外源基因导入到早期的胚胎内，使之可以在动物染色体基因组内稳定的整合，并能遗传给后代的一类动物。随着转基因技术以及分子遗传学的发展，转基因动物模型逐渐应用在医学科学的各个领域。本文对转基因动物模型的几种常用建模方法做一综述，探讨各种不同的转基因动物模型制作方法的优劣。最后以显微注射法为例简述制作转基因动物的方法。

关键词：转基因；动物模型；显微注射法

中图分类号：R-332 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.01.014

文章编号：1006-1959（2018）01-0035-03

Development of Transgenic Animal Models

SUN Fu1，YANG Jiao2，WU Wen-huan2，WANG Lei1，TIAN Yu1

（1.First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College，Xi'an 710077，Shaanxi，China；

2.Xi'an Medical College，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Transgenic animals are the experimental methods used to introduce exogenous genes into early embryos so that they can be stably integrated in the genome of animal genomes and can be passed on to offspring animals.With the development of transgenic technology and molecular genetics， transgenic animal models are gradually applied in various fields of medical science.This article reviews several commonly used modeling methods for transgenic animal models and discusses the advantages and disadvantages of various methods for making transgenic animal models. Finally，the microinjection method as an example to describe the method of making transgenic animals.

Key words：Transgene；Animal model；Microinjection

转基因动物（transgenic animals）是指应用实验的方法将外源基因导入到早期的胚胎内，使之可以在动物染色体基因组内稳定的整合，并能遗传给后代的一类动物。转基因动物所有的细胞均整合有外源基因，并具有将外源基因遗传给子代的能力，若动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物，这类动物只有在整合了外源基因的“局部组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代。随着遗传操作技术的不断发展，转基因动物技术已经广泛的应用于疾病发病机制、基因功能、药物筛选、治疗效果评价等多个方面的研究[1]。1980年Gordon等向单核胚胎的原核内注射纯化的DNA从而制成了第一只转基因小鼠。2年后Palmiter等将重组的大鼠生长激素基因注入小鼠的受精卵原核，从而制成了生长速度明显增快的超级鼠[2]。1987年Capecdhi等根据同源重组的原理，实现了导入的外源基因的定点整合，亦称之为基因打靶技术[3]。从此转基因技术逐渐成熟并应用于生物学、医学等多个领域。虽然目前转基因动物模型的制作方法多种多样，但是在实验室应用中仍存在较多问题，各种不同的转基因动物模型制作方法各存在其自身的优缺点。本文对目前实验室应用较多的几种转基因动物模型制作方法逐一回顾，分析其中的优缺点，希望能够找到一种目前应用最广泛的制作转基因动物模型的方法[4]。目前实验室制作转基因动物模型的方法根据外源基因导入的方法和对象的不同可以分为以下几种：分别为显微注射法、精子载体导入法、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）法、反转录病毒法、电脉冲法、等[5]，我们将在本文逐一介绍。

1显微注射法

显微注射法是目前最常用并且是实验室应用最成熟的专基因动物模型制作方法，其大致的过程如下：首先，选取6～8 w龄的雌性小鼠，向其腹腔内注射血清促性腺激素（pregnant mare serum gonactotropin，PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（humar chorionic gonactotropin，HCG），促进排卵。然后将其与雄性小鼠1：1交配。交配成功的标志是在雌性小鼠的阴道口发现白色的阴道栓。次日上午，将确认有阴道栓的雌性小鼠用颈椎脱臼法剖杀，取出输卵管，仔细冲洗后小心取出受精卵。受精卵中有两个原核，分别来自精子和卵子，向雄性原核中注入DNA溶液。用结扎了输精管的雄性小鼠与发情期的雌性小鼠交配，刺激雌性小鼠的子宫颈管，造成假孕雌性小鼠。將受精卵移植至交配第3 d的假孕鼠输卵管中，使之正常发育，操作时注意，因为DNA注入可能造成损伤，因此许多受精卵在中途停止发育，因此建议在注射时采用双侧多受精卵移植的方法。在注射成功后，应用PCR法对导入的遗传基因进行分析，挑选出外源性基因导入成功的小鼠进行饲养和繁殖[6]。endprint

显微注射DNA的方法目前应用较多，是实验室真正成熟并可以稳定生产转基因动物的有效方法。但在其制作过程中仍涉及复杂的操作过程[7]。首先，在制作过程中要注意掌握母畜的性周期，使母畜在预先设定的时间内排卵，以保证获得大量刚刚受精的单细胞胚胎。其次，此种方法制作的转基因动物只能约占子代中的1%～3%，效率较低，但是结果相当稳定，并且成本较低，是目前实验室常用的一种值得推荐的方法[8]。

2精子导入法

利用雄性精子作为外源性基因，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中的方法称为精子导入法，是制作转基因动物的一种新的方法。此方法把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力，然后用携带有外源基因的精子给母畜受精，在母畜的后代中就会产生一定比例的动物是整合了外源基因的动物。该法简单、方便。与显微注射法，其成本较低，同时不涉及对动物进行手术处理，因此其操作相对简单[9-10]。但在实践过程中仍然发现这种方法成功率较低，而且对于精子是否可作为外源DNA载体也存在争论。因此目前这项技术仍处在早期探索阶段，仍需进一步实验室研究。应用此种方法可以将人工授精、体外受精与转基因结合起来。

3胚胎干细胞法

胚胎干细胞（ES细胞）是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，将其进行体外培养，扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞，将注射过的胚胎经培养后筛选无发育缺陷的囊胚，移植到交配第3 d的假孕受体动物子宫内，培育出转基因动物。这种办法外源基因整合率较高，但是不易建立ES细胞系。并且在实验过程中要通过嵌合体途径，因此实验周期比较长[11-12]。胚胎干细胞法外源基因的整合率较高，實验者可以在植入囊胚前选择合适转化的ES细胞，避免了以前只能在子代筛选的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是一种目前实验室很有前途的技术。但是它同样存在缺点，比如不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。但是，仍是目前实验室较有前景的一种转基因动物模型制作方法。

4反转录病毒法

反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞的染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎后，将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物[13]。

该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10 kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达[14]。

5电脉冲法

电脉冲法（electroporation）又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。目前在动物中电脉冲法主要用来转化胚胎干细胞[15]。

以上方法是目前实验室制作转基因动物模型常用的几种方法，各自有其优缺点，适用于不同的转基因模型制作过程。我们以显微注射法为例，简述转基因细胞的制作过程。用显微注射法制作的第一代子鼠为嵌合体子鼠，因此并非子鼠全部细胞中均有导入的外源基因，为了得到纯合子的转基因小鼠，还需用产生的雄性小鼠与提供囊胚的雌性小鼠交配，也称作回交[16]。回交后产生的子代小鼠有两种，野生型与杂合体。将杂合体小鼠互交后产生的子代鼠中会有野生型，杂合体和纯合体三种，通过PCR的方法可以将纯合体挑选出来，再进行繁殖，这样就能够得到稳定的转基因小鼠品系[17-18]。

转基因动物技术是上世纪八十年代发展起来的一种高新生物技术，近年来得到了飞速发展，转基因动物在生命科学研究中的重要性也越来越受到人们的重视。转基因动物技术的核心，是把遗传的功能单位─基因转移到动物体内，使它成为动物体内的一部分。被转移的基因可以来自同种或异种动物，也可以来自植物或微生物[19]。这样一来，就打破了物种之间的界线，也可以说动物能与植物、微生物杂交了。目前，转基因动物模型大部分局限于单个基因的转移，随着科学技术的发展，我们预料未来会出现多个基因的同时转移，那么转基因动物模型的应用范围又将极大扩展。在转基因动物方面，我国也取得了许多优秀的成果，目前已获得了转基因鱼、兔、鸡等多种转基因动物[20-21]。虽然目前围绕转基因技术的应用仍然存在一些争论，但是我们认为随着科学技术的进一步发展，转基因技术必将拥有更为广泛的应用前景。

参考文献：

[1]刘红林.转基因动物制备技术[J].中国猪业，2016，11（4）：60-61.

[2]张赟，周国丽，杨冉，等.高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立[J].河南科学，2017，35（2）：204-208.

[3]Jolivet G，Braud S，Dasilva B，et al.Induction of body weight loss through RNAi-knockdown of APOBEC1 gene expression in transgenic rabbits.[J].Plos One，2014，9（9）：e106655.

[4]陈宇浩，马达灵，贺番，等.病毒载体及其在转基因动物中的应用[J].探索科学，2016（9）：379.

[5]余科科，汪思应.转基因小鼠在生命科学中的研究进展[J].医学综述，2015，21（1）：23-24.

[6]董贤慧，高维娟，贺小平，等.淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病转基因模型小鼠大脑皮质DM T1表达的影响[J].重庆医学，2016，45（16）：2176-2179.endprint

[7]张春丽，李忠海，周颖，等.构建骨质疏松动物模型建模方法的改进及评价[J].中国组织工程研究，2016， 20（5）：754-759.

[8]Wang Q，Qian L，Jiang S，et al.Safety Evaluation of Neo Transgenic Pigs by Studying Changes in Gut Microbiota Using High-Throughput Sequencing Technology[J].Plos One，2016，11（3）：e0150937.

[9]黄爱良，黄荣志，黄小倩，等.动脉粥样硬化动物模型构建的方法与现状[J].中国组织工程研究，2015（27）：4423-4428.

[10]Sarkar T，Thankappan R，Kumar A，et al.Stress Inducible Expression of AtDREB1A Transcription Factor in Transgenic Peanut（Arachis hypogaea L.）Conferred Tolerance to Soil-Moisture Deficit Stress[J].Frontiers in Plant Science，2016，7（935）.

[11]Maksimenko OG，Deykin AV，Khodarovich YM，et al.Use of Transgenic Animals in Biotechnology：Prospects and Problems[J].Acta Naturae，2013，5（1）：33-46.

[12]Deepanker Y，Israr A，Pawan S，et al.Overexpression ofArabidopsis Ann At 8 Alleviates Abiotic Stress in Transgenic Arabidopsisand Tobacco[J].Plants，2016，5（2）：18.

[13]Okamoto K W，Fred G，Lloyd A L.Integrating Transgenic Vector Manipulation with Clinical Interventions to Manage Vector-Borne Diseases[J].Plos Computational Biology，2016，12（3）：e1004695.

[14]Park JE，Xian FZ，Choi SH，et al.Generation of transgenic marmosets expressing genetically encoded calcium indicators[J].Scientific Reports，2016，6：34931.

[15]Eissa HF，Hassanien SE，Ramadan AM，et al.Developing transgenic wheat to encounter rusts and powdery mildew by overexpressing barleychi 26 gene for fungal resistance[J].Plant Methods，2017，13（1）：41.

[16]李乐，缪卫国，刘文波，等. 全长和缺失信号肽类似序列的HpaXm转基因烟草及其抗病性比较[EB/OL].北京：中国科技论文在线 [2015-01-20].http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201501-327.

[17]李国玲，钟翠丽，莫健新，等.动物基因组定点整合转基因技术研究进展[J].遗传，2017，39（2）：98-109.

[18]Nageswara-Rao M，Hanson M，Agarwal S，et al.Genetic diversity analysis of switchgrass（Panicum virgatum，L.）populations using microsatellites and chloroplast sequences[J].Agroforestry Systems，2014，88（5）：823-834.

[19]Ogo Y，Wakasa Y，Hirano K，et al.Generation of transgenic rice with reduced content of major and novel high molecular weight allergens[J].Rice，2014，7（1）：1-9.

[20]Wang H，Wu H，Wang K，et al.Expression of recombinant human lysozyme in transgenic chicken promotes the growth of Bifidobacterium，in the intestine and improves postnatal growth of chicken[J].Amb Express，2016，6（1）：110.

[21]Zhang J，Yu H，Zhang Y，et al.Increased abscisic acid levels in transgenic maize overexpressing AtLOS5 mediated root ion fluxes and leaf water status under salt stress[J].Journal of Experimental Botany，2016，67（5）：1339.

收稿日期：2017-7-21；修回日期：2017-8-20

編辑/李桦endprint