吴 萍，熊爱兵

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS)常表现为表面颜色鲜红，局部增厚变硬，过度生长，凸出于正常皮肤表面。尤其是烧烫伤创面，瘢痕增生严重，不仅影响美观，关节处或某些器官瘢痕挛缩甚至严重影响患者日常生活，造成一定的心理和社会危害。增生性瘢痕形成的机制仍有待研究。通过对正常皮肤组织与增生性瘢痕组织的研究对比发现，后者毛细血管密度更高[1]。内皮抑素是一种血管内皮细胞抑制剂，能通过抑制微血管生成从而抑制瘢痕增生。重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rbFGF）是一种多功能细胞生长因子，大量研究表明其具有促进创面愈合的作用。该实验拟建立兔耳瘢痕模型，研究内皮抑素联合外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子对增生性瘢痕的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

健康成年新西兰大耳兔12只，购自西南医科大学动物实验中心，雌雄不拘，体重2.0～2.5 kg；重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rbFGF，商品名贝复济），珠海亿胜生物制药厂生产；重组人血管内皮抑制素（商品名恩度），山东先声麦得津生物制药有限公司生产；DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；鼠抗兔CD34抗体、兔抗兔GAPDH抗体，abcam生产；兔抗兔bFGF抗体，bioss公司生产；BCA蛋白质浓度测定试剂盒，ASPEN公司生产；鼠抗兔Bcl-2抗体，博士德公司生产。

1.2 模型制作及分组

以Morris方法为参考建模:用1%戊巴比妥钠1mL/kg做耳缘静脉麻醉后，固定满意，消毒，铺巾。用自制打孔器在兔耳腹侧作直径为1.0 cm×1.0 cm创面，去除兔耳全层皮肤并刮除软骨膜，每只兔耳作6个相同创面，每个间隔0.5 cm，共计144个创面，术后创面暴露。术后一周再创伤，除去痂壳形成二次创面。待创面自行愈合，一般需15～20 d。实验为4组，每组3只。A组（贝复济组）、B组（内皮抑素组）、C组(贝复济+内皮抑素组)、D组（生理盐水组）。分组处理如下:A组、C组创面形成当日即开始喷洒贝复济至创面痊愈，实验B组、C组于术后第21 d开始腹腔注射内皮抑素，剂量为1.5 mg/5 mL，D组注射等量生理盐水。每天1次连续注射一周。

1.3 取材

药物注射后第14 d，切取各组瘢痕组织。将所取组织从顶部均分为两份，一半作HE染色，另一半作分子生物学检测。

1.4 观察和检测

1.4.1 大体观察

各组每日观察并记录创面术后伤口愈合、上皮化时间及瘢痕生长过程；并记录创面渗出、色泽、质地、大小变化情况及术后瘢痕增生情况。观察药物注射当天和注射后第7、10、13 d瘢痕颜色、硬度。

1.4.2 HE染色

组织学标本用甲醛（体积分数为10%）固定，常规石蜡包埋切片，苏木素伊红染色(HE)，行光镜观察成纤维细胞及胶原纤维。

1.4.3 免疫组织化学检测CD34、bFGF

采用SP免疫组织化学法，按试剂盒说明书操作。其中一抗为兔抗兔bFGF多克隆抗体、鼠抗兔CD34多克隆抗体，稀释浓度均为1∶100，二抗为HRP标记山羊抗兔、HRP标记山羊抗小鼠等，稀释浓度为1∶200。DAB显色，苏木精复染，光镜下观察并摄片。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析阳性染色的平均光密度值。

①通过检测微血管内皮细胞标志物CD34表达，间接反映增生性瘢痕组织中的微血管密度，计算CD34阳性细胞百分比，每片组织取5个高倍镜（×400）视野，以视野中阳性细胞所占比例的均值表示。②bFGF表达检测结果判定:每张切片随机采集5个高倍镜(×400)视野（棕黄色颗粒状着色为阳性表达），以视野中阳性细胞所占比例的均值表示。

1.4.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Bcl-2蛋白分子表达情况

成功提取胞浆胞核蛋白后，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，保证每个样品总蛋白上样量均为40 μg，依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育，滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，曝光，根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，统计方法采用方差分析（F检验），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体观察结果

造模后第21 d，各组均可见明显增生性瘢痕，色暗红，触之较硬，表明兔耳瘢痕模型建造成功。伤后第42 d，肉眼见各组均形成锥形瘢痕，生理盐水组瘢痕增生最明显，颜色暗红，充血明显；内皮抑素组和内皮抑素联合贝复济组肉眼未见明显差异，与生理盐水组对比，瘢痕增生高度较小，呈轻度增生隆起，色呈淡红色。

2.2 病理切片HE染色观察

生理盐水组见明显粗大紊乱纤维，部分纤维断裂。与生理盐水对照组相比，贝复济组、内皮抑素组及内皮抑素与贝复济联合应用组排列相对整齐，纤维结构更为纤细。其中，内皮抑素与贝复济联合应用组排列最整齐（图1）。

图1 四组切片HE染色结果（×400）

2.3 CD34及bFGF免疫组化结果

免疫组织化学CD34染色结果显示:A组(22.84± 0.3)%，B组（12.7± 0.53）%，C组（5.93± 0.57）%，D组（41.96±03.82）%，C组分别与A组、B组、D组比较，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1、图2、图4）

免疫组化bFGF染色结果：A组（133765.37±5316.70）%，B组（296209.91±22961.17）%，C组（552960.53±56787.72)%，D组（58571.32±2414.95）%，C组分别与A组、B组、D组比较，两组间比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。（表1、图3、图4）

表1 各组CD34、bFGF阳性率比较（n=36，x±s）

图2 四组切片CD34免疫组化染色结果（SP法，×400）

图3 四组切片bFGF免疫组化染色结果（SP法，×400）

图4 各组瘢痕组织免疫组化染色结果比较

2.4 Bcl-2检测结果

A组(0.341±0.029)%，B组(0.201±0.015)%，C组(0.076±0.015)%，D组（0.539±0.063)%，C组分别与A组、B组、D组比较，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)（表2、图5）。

表2 各组Bcl-2阳性率比较（n=36，x±s）

图5 四组Bcl-2蛋白免疫印迹检测结果

3 讨 论

增生性瘢痕形成机制十分复杂，多种细胞、细胞因子和生长因子等参与了这个过程。内皮抑素是抑制血管生长最重要的因子，大量研究表明，内皮抑素除能抑制内皮细胞迁移增殖、促进内皮细胞凋亡，还能抑制基质金属蛋白酶等，从而减轻血管增生。王西樵等[2]通过研究发现，内皮抑素通过抑制瘢痕血管生成，减少瘢痕营养及氧供的同时，也破坏了成纤维细胞周围微环境而致使其功能减退和凋亡，从而减轻兔耳瘢痕形成并促进瘢痕消退及成熟。因此，抑制瘢痕血管生成即可减轻瘢痕增生。近期有研究[3-4]发现，预防血管过度增生是防治瘢痕的关键及有效方法，增生性瘢痕的消退与内皮功能障碍有密切关系。有研究表明内皮抑素抑制瘢痕增生主要是通过抑制增生性瘢痕中成纤维细胞增殖[5]。本实验组织学结果显示，内皮抑素组与生理盐水对照组相比，应用内皮抑素组纤维排列较整齐，微血管密度明显降低，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明内皮抑素抑制瘢痕组织中血管增生从而减轻瘢痕。

bFGF是最有效的血管促进因子之一，具有促进创面修复和组织再生的作用。虽然贝复济（rbFGF）已广泛应用于临床，但bFGF是否会导致瘢痕增生也众说纷纭。程彪等[6]证明外用bFGF可以增加创面TGF-β1，促进成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，加快创面愈合，同时级联其他生长因子及细胞因子通路，加速修复细胞的凋亡。徐祥[7]发现bFGF与众多血管促进因子具有协同作用，外用bFGF能够使VEGF等因子表达增强，促进微血管生成，加速创面愈合。在促血管生成过程中，bFGF与VEGF二者相辅相成，必须同时存在才能达到促血管效果。有学者发现，bFGF能促进成纤维细胞凋亡，产生无瘢痕修复[8]。本研究组织学结果显示，应用贝复济后微血管数明显降低，两组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）；可以认为外用贝复济能减轻血管形成，减轻增生性瘢痕形成。

当内皮抑素促进内皮细胞凋亡的同时，血管内皮细胞产生的细胞因子等也会减少。有研究者发现内皮抑素通过下调VEGF和TIMP-1减轻兔耳增生性瘢痕形成[9]。bFGF可使内皮细胞中的存活素(Sur⁃vivin）表达上调，而存活素可能通过抑制内皮细胞凋亡、促进新生血管生成，为成纤维细胞的增生提供过量的氧气和养料促进瘢痕增生。樊丁才[10]发现bF⁃GF可增加MMP-1含量，降解胶原蛋白，减轻细胞外基质沉积，从而抑制瘢痕增生。贝复济在创面愈合早期使用意义更大。本实验早期外用贝复济，创面上皮化后应用内皮抑素，结果表明组织中bFGF量增加，其中贝复济联合内皮抑素组升高最明显，推测其可能原因为贝复济早期促进创面形成较多血管，但随创面愈合，成纤维细胞凋亡、炎性细胞减少，应用内皮抑素后，促进血管内皮细胞凋亡。有学者证实血管内皮细胞旁分泌细胞因子的量远远大于成纤维细胞的自分泌[11]。通过各因子间级联反应，影响其与相应受体结合，从而形成较高浓度bFGF的微环境。张晓明等[12]研究证实应用内皮抑素后，瘢痕组织中bFGF表达上调，但VEGF表达降低，因此不会促进瘢痕增生。

Bcl-2是抑凋亡基因，与细胞凋亡有密切联系，当其表达降低时细胞凋亡加快。任海涛[13]通过腹腔注射内皮抑素发现内皮抑素可以下调Bcl-2，促进内皮细胞凋亡，抑制血管形成，使内皮细胞释放促纤维化的细胞因子减少。程彪等[6]人证明外用贝复济能加速修复细胞凋亡。本实验进一步证实内皮抑素下调Bcl-2，同时贝复济组与生理盐水对照组相比、内皮抑素组与内皮抑素联合贝复济组相比较，表明外用贝复济也可下调Bcl-2，促进内皮细胞凋亡，且两药联用后有协同作用。

4 结 论

外用贝复济联合腹腔注射内皮抑素可以减轻增生性瘢痕的形成，表明内皮抑素与贝复济联用不仅不会削弱两药药效，反而可产生协同作用。且本实验表明，应用贝复济和内皮抑素后，瘢痕中微血管数明显降低，其机制可能是内皮抑素与贝复济共同下调Bcl-2，促进血管内皮细胞凋亡，减少增生性瘢痕的血液供应，从而减轻瘢痕。本实验为两药联用治疗创面增生性瘢痕提供了一定的理论依据。近来已有研究者[14]将内皮抑素应用于临床改善瘢痕及预后，且该方法被证实有效，期待有更多相关研究及后续报道。

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