朱杭 林士明 王栋 诸力 何永江 王坚 潘浩

椎间盘退变是机体正常的退化过程，椎间盘细胞外基质丢失是其典型特征[1]。椎间盘突出引起的神经根性疼痛与背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）受压、髓核接触神经根后诱导的炎性反应或自身免疫反应有关[2-6]。髓核突出后诱导的神经根性炎症反应极其复杂，各种促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等参与其中[7-9]；此外，免疫球蛋白、氢、一氧化氮（NO）也参与其中[10]。核因子-κB（NF-κB）在炎症反应应激过程中起着关键的作用，其参与多种疾病的发病[11-14]。在退化的椎间盘内作为NF-κB靶基因的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8水平增加[15-16]，表明NF-κB参与了椎间盘的退行性改变。此外，在退化的椎间盘内NF-κB传导信号通路也被激活，尤其在髓核组织中，并显示与累积的氧化应激和基质丢失相关[17-18]。酸敏感离子通道（acid sensing ion channel，ASIC）蛋白是阿米洛利敏感性Na+通道/变性蛋白家族的成员，其形成同聚和异聚功能膜通道[19]，其中ASIC3已被证实与缺血、炎症或组织酸中毒相关疼痛的传导紧密相关，使髓核适应椎间盘的酸性和高渗微环境。本研究拟观察NF-κB和ASIC3信号通路阻断剂PDTC和阿米洛利对髓核致炎大鼠DRG中NF-κB和ASIC3表达的影响，并检测大鼠后足机械刺激缩足阈值（pain withdrawal threshold，PWT）及外周血和 DRG 中 NO、TNF-α、IL-6水平，以探索 NF-κB和ASIC3在髓核组织诱导发生神经根性疼痛的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物条件 80只清洁级成年雄性SD大鼠，体重220～240g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXY（浙）2013-0016。实验在浙江中医药大学实验动物中心进行，实验室温度22～25℃、12h明暗循环，大鼠自由饮水摄食。实验程序遵循美国国立卫生研究院制定的《实验动物护理和使用指南》（第9版，2010年）。动物实验方案通过浙江中医药大学医学动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 手术方法 通过腹腔内注射水合氯醛（100g/L）麻醉大鼠。以大鼠髂嵴最高点连线为中心作25～30mm正中纵切口暴露脊柱及两侧组织，切除L5下关节突、L6上关节突和L5半椎板，暴露左侧L5DRG及部分脊髓硬膜囊。采用18G的皮肤穿刺针头在L5～6椎间盘进行穿刺，针头用持针器夹持，尖端保留5mm长度，于纤维环前外侧方平行终板方向刺入，深度控制在5mm，刺入后维持5s；然后，断尾，纵向切开鼠尾根部，从2个椎间盘内取髓核组织共0.4mg，置于L5DRG上，术毕逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤。术后肌肉注射2万U青霉素（80万 U/0.48g，H37021359，齐鲁制药有限公司）预防感染。

1.2.2 实验分组及给药方法 80只大鼠采用随机数字表法分为5组，对照组、模型组、阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组，每组16只。各组处理及给药方法如下：（1）对照组在上述手术过程中暴露L5DRG后直接缝合。（2）模型组按上述手术方法进行造模。（3）阿米洛利组按上述手术方法进行造模，并于术后2周内每天腹腔内注射20μg/kg阿米洛利（H10900015，美国Sigma公司）。（4）PDTC组按上述手术方法进行造模，并于术后2周内每天腹腔内注射20μg/kg PDTC（S1809，美国Sigma公司）。（5）阿米洛利+PDTC组按上述手术方法进行造模，并于术后2周内每天腹腔内注射20μg/kg阿米洛利和20μg/kg PDTC。对照组和模型组不进行药物干预。术后1、3、7、14d，每天随机处死3只大鼠并取出L5DRG，采用5ml注射器刺入L5～6椎间隙水平内取外周血，-20℃保存。

1.2.3 大鼠后足PWT测定 各组随机选取4只大鼠分别于术后 2、4、6、8、10、12d 采用 Up-Down 法测定大鼠后足PWT。检测工具为8根强度呈对数递增方式的Von Frey纤毛机械刺激针（BIO-EVF3，上海玉研科学仪器有限公司），间隔5min重复刺激3次，初始刺激强度为2.04g，每次刺激时间为4～6s。在测试前30min，将大鼠置于测定PWT值用的笼子内适应测试环境。

1.2.4 ASIC3、NF-κB p65、TNF-α 和 IL-6 mRNA 表达水平测定 采用RT-PCR法。术后14d，以Trizol法提取L5DRG中总RNA。取1μg总RNA进行逆转录。逆转录条件：37℃ 60min，85℃ 5min，4℃ 5min。以 GAPDH为内参，设计引物：ASIC3上游为 5′-CGCTATGTGGCTCGGAAGTG-3′，下游为 5′-TGTAGGACTCGCTGCGGTTG-3′；NF-κB p65 上 游 为 5′-TTTAGCCT-GCTGGCGGTTCC-3′，下游为 5′-ACCGAGTGCAGCCGTGATTG-3′；TNF-α 上游为 5′-CTGAGGTCAACCTGCCCAAG-3′，下游为 5′-GGCTGGGTAGAGAACGGATG-3′；IL-6 上游为 5′-CACCAGGAACGAAAGTCAAC-3′，下游为 5′-GGCTGTCAACAACATCAGTC-3′。通过逆转录合成的cDNA 2μl进行RT-PCR扩增。RT-PCR 反应条件为：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s循环扩增。采用ABI Prism 7300 SDS（美国ABI公司）仪器分析数据。

1.2.5 ASIC3、NF-κB p65、TNF-α 和 IL-6 蛋白表达水平测定 采用Western blot法。术后14d，将DRG剪成细小的碎片，按每20mg加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃12 000g离心15min，取上清液，进行蛋白含量测定。蛋白含量采用紫外分光光度法在562nm处进行测定。灌胶上样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳后，半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用立春红染色观察转印是是否成功，5%脱脂奶粉的Tris缓冲液4℃过夜封闭，洗膜后分别加入兔抗鼠 ASIC3（1∶400）、NF-κB p65（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）一抗溶液，4℃杂交过夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1 000稀释的二抗杂交 1h后，取出用洗膜液冲洗，ECL显色，并使用Image J.1.46软件分析灰度值。

1.2.6 TNF-α和IL-6水平测定 采用ELISA法测定术后1、3、7、14d外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平。试剂盒由上海恒斐生物科技有限公司提供。1.2.7 NO水平测定 将外周血和DRG以1 000g离心10min，收集上清液，使用NO测定试剂盒（型号A012，南京建成生物工程研究所）在术后1、3、7、14d测定NO水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表达水平的比较 模型组、阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白水平均高于对照组（均P＜0.05），而阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表达水平均低于模型组（均P＜0.05），见图1。

图1 5组大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表达水平比较（a：5组大鼠NF-κB p65和ASIC3的mRNA表达水平比较；b：5组大鼠NF-κB p65和ASIC3蛋白表达电泳图；c：5组大鼠NF-κB p65和ASIC3的蛋白表达水平比较）

2.2 大鼠后足 PWT的变化情况 术后 2、4、6、8、10、12d模型组大鼠后足PWT与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组大鼠后足PWT术后8d内下降，之后逐渐增加；术后10、12d阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组大鼠后足PWT明显高于模型组，差异均有统计学意义（均 P＜0.01），见图2。

图2 大鼠后足PWT的变化情况

2.3 5组大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表达水平的比较 模型组、阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组大鼠外周血和DRG中术后1、3、7、14d的NO、TNF-α和IL-6表达水平较对照组显著上调（均 P＜0.01），且模型组术后 3、7、14d 的 NO、TNF-α和IL-6表达水平较阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组也显著上调（均P＜0.01），见图3。通过RTPCR法和Western blot法测量5组大鼠DRG也发现类似的结果，见图4。

图3 5组大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表达水平比较（a、b：5组大鼠外周血和DRG中NO表达水平比较；c、d：5组大鼠外周血和DRG中TNF-α表达水平比较；e、f：5组大鼠外周血和DRG中IL-6表达水平比较）

图4 5组大鼠DRG中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达水平比较（a：5组大鼠IL-6和TNF-α的mRNA表达水平比较；b：5组大鼠IL-6和TNF-α蛋白表达电泳图；c：5组大鼠IL-6和TNF-α蛋白表达水平比较）

3 讨论

椎间盘是由髓核和纤维环组成的特殊生物力学结构，髓核细胞外基质由蛋白多糖和蛋白聚糖组成，使组织具有较高的渗透压，使其适应所施加的机械负荷。最近许多研究把焦点转移到由髓核组织与神经根和周围组织接触引发的炎症过程[10，20]。本研究通过将髓核置于DRG的模型组与未将髓核置于DRG的对照组比较，发现模型组DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白质水平显著增加，表明髓核组织可以刺激NF-κB和ASIC3在DRG的表达。而腹腔内注射PDTC或/和阿米洛利则显著抑制由髓核组织暴露DRG中NF-κB和ASIC3的表达。

机械痛觉过敏是炎症过程的特征性特点，在于感受伤害阈值的降低和对于热和机械刺激的敏感性增加[21]。本研究模型组中大鼠后足PWT在术后12d内持续下降，在10d时下降最为明显。然而，由髓核组织诱导的痛觉过敏在阿米洛利或/和PDTC组中得到显着改善，在术后8d开始显著上升，表明ASIC3和NF-κB可能与机械痛觉过敏有紧密的联系，ASIC3的特异阻断剂阿米洛利和NF-κB抑制剂PDTC可减轻机械痛觉过敏。

细胞炎性因子与神经肽的增加相关，用其抑制剂可以减少外周和中枢神经系统疼痛[22-23]。本研究模型组术后14d，通过ELISA和生化检测到外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6水平均增加。通过Western blot法也同样检测到DRG中TNF-α和IL-6水平均增加。阿米洛利组、PDTC组和阿米洛利+PDTC组显著抑制了术后3、7、14d内NO、TNF-α和IL-6水平的上调，表明NF-κB和ASIC3与炎症过程密切相关，可使多种细胞炎性因子的表达上调并增强这些介质的疼痛加强作用。而PDTC或/和阿米洛利通过抑制NF-κB和ASIC3的表达从而降低细胞炎性因子的表达，减缓局部的炎症反应。

综上所述，椎间盘突出发生后，髓核介导的炎症反应可以引起NF-κB和ASIC3在DRG中的表达上调，而NF-κB和ASIC3可相互影响通过抑制NO及多种细胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表达，减弱髓核组织对DRG的炎症损伤而致的痛觉过敏，减缓神经根性疼痛。

[1]Wuertz K,Vo N,Kletsas D,et al．Inflammatory and catabolic signalling in intervertebral discs:the roles of NF-kappaB and MAP kinases[J]．Eur Cells Mater,2012,23:103-119．

[2] Tan ZY,Donnelly DF,LaMotte RH．Effects of a chronic compression of the dorsal root ganglion on voltage-gated Na+and K+currents in cutaneous afferent neurons[J]．J Neurophysiol,2006,95(2):1115-1123．doi:10．1152/jn．00830．2005．

[3] Igarashi T,Yabuki S,Kikuchi S,et al．Effect of acute nerve root compression on endoneurial fluid pressure and blood flow in rat dorsal root ganglia[J]．J Orthop Res,2005,23(2):420-424．doi:10．1016/j．orthres．2004．08．026．

[4]Basbaum AI,Brz JM．Transgenic mouse models for the tracing of"pain"pathways．In:Kruger L,Light A R,editors．Translational Pain Research:From Mouse to Man[M]．Boca Raton,FL:CRC Press/Taylor&Francis,2010:Chapter 7．

[5] de Souza Grava AL,Ferrari LF,Defino HL．Cytokine inhibition and time-related influence of inflammatory stimuli on the hyperalgesia induced by the nucleus pulposus[J]．Eur Spine J,2012,21(3):537-545．doi:10．1007/s00586-011-2027-8．

[6] Miyoshi S,Sekiguchi M,Konno S,et al．Increased expression of vascular endothelial growth factor protein in dorsal root ganglion exposed to nucleus pulposus on the nerve root in rats[J]．Spine,2011,36(1):1-6．

[7] Weber KT,Alipui DO,Sison CP,et al．Serum levels of the proinflammatory cytokine interleukin-6 vary based on diagnoses in individuals with lumbar intervertebral disc diseases[J]．Arthritis Res Ther,2016,18:3．doi:10．1186/s13075-015-0887-8．

[8] Li K,Li Y,Ma Z,et al．Crocin exerts anti-inflammatory and anti-catabolic effects on rat intervertebral discs by suppressing the activation of JNK[J]．Int J Mol Med,2015,36(5):1291-1299．doi:10．3892/ijmm．2015．2359．

[9] Abraham AC,Liu JW,Tang SY．Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model[J]．J Orthop Res,2016,34(8):1431-1438．doi:10．1002/jor．23325．

[10] 康玉南,刘华水．炎症在椎间盘退行性病变中的研究[J]．中国实用医药,2017,12(12):188-189．doi:10．14163/j．cnki．11-5547/r．2017．12．096．

[11]Imagawa K,de Andres MC,Hashimoto K,et al．The epigenetic effect of glucosamine and a nuclear factor-kappa B(NF-κB)inhibitor on primary human chondrocytes--implications for osteoarthritis[J]．Biochem Biophys Res Commun,2011,405(3):362-367．doi:10．1016/j．bbrc．2011．01．007．

[12] Feng J,Liu S,Ma S,et al．Protective effects of resveratrol on postmenopausal osteoporosis:regulation of SIRT1-NF-κB signaling pathway[J]．Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2014,46(12):1024-1033．doi:10．1093/abbs/gmu103．

[13] Li J,Chen R,Cai G．Targeting NF-κB and TNF-α activation by electroacupuncture to suppress collagen-induced rheumatoid arthritis in model rats[J]．Altern Ther Health Med,2015,21(4):26-34．

[14] Miao GS,Liu ZH,Wei SX,et al．Lipoxin A4 attenuates radicular pain possibly by inhibiting spinal ERK,JNK and NF-kappaB/p65 and cytokine signals,but not p38,in a rat model of noncompressive lumbar disc herniation[J]．Neuroscience,2015,300:10-18．doi:10．1016/j．neuroscience．2015．04．060．

[15]Adams MA,Stefanakis M,Dolan P．Healing of a painful intervertebral disc should not be confused with reversing disc degeneration:implications for physical therapies for discogenic back pain[J]．Clin Biomech,2010,25(10):961-971．doi:10．1016/j．clinbiomech．2010．07．016．

[16]Yang H,Liu H,Li X．TNF-α and TGF-β1 regulate Syndecan-4 expression in nucleus pulposus cells:role of the mitogen-acti-vated protein kinase and NF-κB pathways[J]．Connect Tissue Res,2015,56(4):281-287．

[17] Sun Z,Yin Z,Liu C,et al．The changes in the expression of NF-κB in a degenerative human intervertebral disc model[J]．Cell Biochem Biophys,2015,72(1):115-122．doi:10．1007/s 12013-014-0417-3．

[18]Yuan FL,Zhao MD,Jiang DL,et al．Involvement of acid-sensing ion channel 1a in matrix metabolism of endplate chondrocytes under extracellular acidic conditions through NF-κB transcriptional activity[J]．Cell Stress Chaperones,2016,21(1):97-104．doi:10．1007/s12192-015-0643-7．

[19] 胡四平,汪卫星,刘洋,等．局部注射酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利对胫骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响[J]．浙江医学,2013,35(8):623-625．

[20] Ohtori S,Inoue G,Eguchi Y,et al．Tumor necrosis factor-alpha-immunoreactive cells in nucleus pulposus in adolescent patients with lumbar disc herniation[J]．Spine,2013,38(6):459-462．doi:10．1097/BRS．0b013e3182739cb4．

[21]Kobayashi Y,Sekiguchi M,Konno SI．Effect of an acid-sensing ion channels inhibitor on pain-related behavior by nucleus pulposus applied on the nerve root in rats[J]．Spine(Phila Pa 1976),2017,42(11):633-641．doi:10．1097/BRS．0000000000001918．

[22] Cheng X,Ni B,Zhang F,et al．High glucose-induced oxidative stress mediates apoptosis and extracellular matrix metabolic imbalances possibly via p38 MAPK activation in rat nucleus pulposus cells[J]．J Diabetes Res,2016,2016:3765173．doi:10．1155/2016/3765173．

[23] Tu J,Li W,Zhang Y,et al．Simvastatin inhibits IL-1β-Induced apoptosis and extracellular matrix degradation by Suppressing the NF-kB and MAPK Pathways in Nucleus Pulposus Cells[J]．Inflammation,2017,40(3):725-734．doi:10．1007/s10753-017-0516-6．