肖杰华 冶娟

[摘要]目的：对体外培养的小鼠成纤维细胞分别使用3种不同波长（595nm、755nm、1 064nm）的激光照射，观察分析不同波长激光照射对成纤维细胞中I型、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平的影响。方法：采用体外培养新生小鼠成纤维细胞，根据激光照射的波长不同通将其分为对照组6只（不采用激光照射），595nm组6只（采用波长为595nm激光照射），755nm组6只（采用波长为755nm激光照射）及1 064nm组6只（采用波长为1 064nm激光照射）。通过荧光定量（RT-PCR）法测定成纤维细胞I型、Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平。结果：4组间Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平间差异均有统计学意义（P<0.05）；其中1 064nm组的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的相对表达量达到最高，分别为（113.07±2.85）×10-2、（118.72±1.96）×10-2，均显著高于595nm组的[（96.74±1.03）×10-2、（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，755nm组的[（100.02±1.86）×10-2、（109.27±1.02）×10-2，P<0.01]，及对照组的[（87.14±0.82）×10-2、（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]；755nm组Ⅰ型前胶原mRNA的相对表达量显著高于对照组（P<0.01），而其Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平则显著高于595nm组和对照组（P<0.01）；595nm组仅有Ⅰ型前胶原表达水平mRNA显著高于对照组（P<0.01）。结论：激光照射可以诱导成纤维细胞中I型、Ⅲ型前胶原mRNA表达增加。其中，波长为595nm的激光照射仅能促进I型前胶原mRNA表达上调，755nm激光照射后Ⅲ型前胶原mRNA表达上调明显高于595nm激光，而1 064nm激光照射后兩种前胶原mRNA表达水平最高。

[关键词]激光；小鼠成纤维细胞；前胶原I型；前胶原Ⅲ型；mRNA；皮肤老化

[中图分类号]R329 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）12-0125-04

Effects of Three Wavelength Laser Irradiation on the Expression of Procollagen Type Ⅰ and Ⅲ Procollagen mRNA in Cultured Fibroblasts

XIAO Jie-hua1，YE Juan2

（1.Qinghai Health Vocational and Technical College，Xining 810000，Qinghai，China；2. Medical Beauty Center，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810000，Qinghai，China）

Abstract： Objective In vitro cultured mouse fibroblasts were irradiated with 3 different wavelengths （595/755/1 064nm）， and the effects of laser irradiation at different wavelengths on the expression of two types of procollagen （type I， type Ⅲ） in fibroblasts were observed and analyzed. Methods Neonatal mouse fibroblasts were cultured in vitro. According to the wavelength of laser irradiation， it was divided into 6 cases in control group， 6 cases in 595nm group with laser irradiation at 595nm， 6 cases in 755nm group with laser irradiation at 755nm and 6 cases in 1 064nm group laser irradiation at 1064nm. The expression of type I and type Ⅲ procollagen mRNA in fibroblasts was determined by RT-PCR. Results There were significant differences in the expression of procollagen mRNA among the four groups （P<0.05）， and the relative expression of procollagen mRNA in 1 064nm group was the highest[ （113.07±2.85）×10-2，（118.72±1.96）×10-2，P<0.01]，respectively. It was significantly higher than those in 595nm group [（96.74±1.03）×10-2，（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，than those in 755nm group [（100.02±1.86）×10-2， （109.27±1.02）×10-2，P<0.01]. In the control group [（87.14±0.82） ×10-2，（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]. The relative expression of typeⅠprocollagen mRNA in group B was significantly higher than that in control group （P<0.01）， and the expression level of type Ⅲ procollagen mRNA in 755nm group was significantly higher than that in 595nm group and control group （P<0.01）， but only typeⅠprocollagen mRNA in 595nm group was significantly higher than that in control group （P<0.01）. Conclusion Laser irradiation can induce two precollagen （typeⅠ， type Ⅲ） mRNA expression in fibroblasts. The laser irradiation with a wavelength of 595nm can only promote the up regulation of mRNA expression of type I procollagen， and the up regulation of mRNA expression of type Ⅲ procollagen mRNA after 755nm laser irradiation is significantly higher than that of 595nm laser， while the highest expression level of two procollagen mRNA was observed after 1 064nm laser irradiation.

Key words： laser； mouse fibroblasts； procollagen type I； procollagen type Ⅲ； mRNA； skin aging

胶原蛋白是皮肤真皮的重要组成部分，随着年龄增长，其在人体内的含量也会随之减少。因此，胶原蛋白也被临床作为评估皮肤衰老的重要指标[1]。成纤维细胞是合成分泌胶原蛋白的主要细胞，当皮肤成纤维细胞老化后，其活性下降，分泌的胶原蛋白也随之减少，进而加速了皮肤老化[2-3]。国内外相关研究[4-5]曾表明：非剥脱性激光照射可以加速成纤维细胞的增殖分化。且激光治疗的嫩肤效果明显，已被广泛应用于皮肤美容中。基于此，本文使用了3种不同波长的激光照射成纤维细胞，进一步研究讨论不同激光作用下，I型和Ⅲ型前胶原mRNA表达水平是否存在差异，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器：选取出生2个月的健康昆明小鼠，均为雌性，体重（34±2）g，由广州市赛柏诺生物科技有限公司提供。倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；595nm脉冲染料激光（PDL），购自美国赛诺秀公司；755nm翠绿宝石激光（GentleLase），Q开关1 064nm激光（ND：YAG），755nm、1 064nm激光仪均购自美国Candela公司；PCR仪购自美国ABI公司；TM 2 200凝胶成像系统（Alphaimager），购自北京博嘉兴业科技有限公司；提取总RNA的Trizol试剂购自合肥博美生物科技有限责任公司；荧光定量PCR试剂盒来自美国Pepro Tech 公司。

1.2 檢测方法

1.2.1 体外成纤维细胞培养及分组：根据参考文献的[6]方法收集小鼠皮肤，向DEME培养基内接种成纤维细胞，放置于培养箱中。培养条件：5% CO2、37℃、95%饱和湿度。通过倒置显微镜观察到纤维母细胞边界清楚、呈梭形或多角形胞体，均为贴壁生长，待细胞生长达到相互融合状态后，进行消化传代培养，并将细胞接种于玻璃培养皿中。单个样本：以1ml第2代细胞悬液5×106细胞/ml接种于新的培养皿中为准，根据激光照射的波长不同通将所有样本分为对照组6只，不给予激光照射；595nm组6只，采用波长为595nm的激光照射，脉宽3ms，光斑直径为7mm，能量密度保持为10J/cm2；755nm组6只，采用波长为755nm的激光照射，脉宽及能量密度同595nm组，光斑直径为10mm；1 064nm组6只，采用波长为1 064nm的激光照射，脉宽10ms，光斑直径为3mm，能量密度保持为2.5J/cm2。激光分10个区域垂直照射玻璃培养盖，非重叠全覆盖照射，每天1次，连续照射3d。激光照射结束后继续培养10h。

1.2.2 RT-PCR检测：采用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA；严格按照RT-PCR试剂盒操作，加入Ⅰ、Ⅲ型前胶原上、下游引物进行PCR反应。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察电泳条带图像，以β-actin为内参标准，计算I型、Ⅲ型前胶原电泳条带密度/β-actin比值，即胶原的相对表达量。

1.3 统计学分析：采用软件SPSS 22.0处理数据，计量资料用（x?±s）表示，组间比较行F检验，两两比较行配对t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Ⅰ型前胶原mRNA相对表达量比较：4组间Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，595nm组、755nm组、1 064nm组Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平明显更高（P<0.01）；其中1 064nm组的mRNA的表达水平最高，明显高于595nm组、755nm组（P<0.01），而595nm组、755nm组mRNA的表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1，图1。

2.2 各组Ⅲ型前胶原mRNA相对表达量比较：4组间Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中，1 064nm组的mRNA表达水平最高，明显高于595nm组、755nm组和对照组（P<0.01），而755nm组mRNA的表达水平则显著高于595nm组和对照组（P<0.01），但595nm组mRNA的表达水平与对照比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2，图2。

3 讨论

随着年龄增加，皮肤衰老明显，表现为：松弛、弹性下降等，而这些均是由成纤维细胞失去活性，合成分泌功能减弱有关。成纤维细胞是皮肤真皮的重要组成部分，研究表明：其合成分泌的胶原蛋白，是维持皮肤弹性，修复皮肤创伤的基础[7-8]。因此，增强成纤维细胞活性，促进胶原含量的合成分泌，是抗皮肤衰老的关键[9]。CO2激光是早期剥除式的嫩肤美容技术，虽然能够有效促进真皮及表皮的再生，但术后易出现瘢痕等并发症[10]。而非剥除式激光嫩肤技术出现，正好弥补了这一缺陷，在阻止真皮层受损的同时，还能达到促进胶原再生的目的，且术后并发症少，已被广泛应用于皮肤美容中[11]。目前常用的非剥除式嫩肤的光源有ND：YAG及脉冲染料激光等，其作用的理论基础为国外学者提出的光热解理论[12]。国内外多项研究也已经证实非剥除式嫩肤具有治疗色素沉着、延缓皮肤衰老等作用[13-15]。但关于不同激光技术对于成纤维细胞中胶原蛋白影响的研究还较少。因此，本研究分别选用了3种不同波长的激光照射成纤维细胞，分析讨论其中胶原mRNA的变化。

国内Dang[16]研究报道称：595nm激光治疗可使胶原纤维含量增加，尤其是Ⅰ型前胶原。本研究结果也显示：与对照组相比，595nm I型前胶原mRNA明显增加（P<0.05），但595nm与对照组间的Ⅲ型前胶原mRNA表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示：595nm激光可促进I型胶原的合成，而对Ⅲ型胶原的的影响则较小。原因可能为：该类脉冲染料激光可以穿透真皮，被血管中的血色素吸收，促进细胞因子的释放，并激活成纤维细胞，合成新的胶原蛋白。国内Dang等[17]对昆明小鼠的研究表明：1 064nm激光照射组小鼠皮肤中胶原蛋白较595nm激光照射组明显增加。本研究结果也证实1 064nm的I型和Ⅲ型前胶原mRNA表达均高于595nm组、755nm组及对照组。而刘华绪[18]对昆明小鼠的的研究也证实了：1 064nm激光照射下，非磨削胶原重组效果优于595nm组。提示：激光刺激下，成纤维细胞的胶原含量均有所增加，且波长越长，诱导合的胶原也随之增多。国内研究[19-20]中多采用755nm翠绿宝石激光进行脱毛或治疗的色素性皮肤病。而关于其对胶原影响的研究较少。本研究结果显示：与对照组及595nm组相比，755nm组的Ⅲ型前胶原mRNA表达明显上调，但其与595nm组I型胶原蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）；提示：755nm翠绿宝石激光也能刺激成纤维细胞合成胶原蛋白，尤其是Ⅲ型前胶原。

综上所述，3种激光均能诱导成纤维细胞合成分泌更多的Ⅰ、Ⅲ型前胶原，且1 064nm激光促进胶原合成的效果最好，但本研究尚存在不足指出，如研究范围较小，未分析激光使用周期、炎症反应等因素的影响等，需进一步行大样本研究。

[参考文献]

[1]Oh JK，Kwon OS，Kim MH，et al.Connective tissue sheath of hair follicle is a major source of dermal type I procollagen in human scalp[J].J Dermatol Sci，2012，68（3）：194.

[2]Goel SA，Guo LW，Shi XD，et al.Preferential secretion of collagen type 3 versus type 1 from adventitial fibroblasts stimulated by TGF-β/Smad3-treated medial smooth muscle cells[J].Cell Signal，2013，25（4）：955-960.

[3]李晶冰，丁敏，牟萍，等.积雪草甙对系统性硬皮病成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成及分泌TGF-β1的影响[J].江苏医药，2014，40（20）：2387-2389.

[4]郑振汶，许爱娥，尉晓冬，等.1 320nm激光对成纤维细胞增殖和分泌碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1的影响[J].中华皮肤科杂志，2007，40（12）：743-745.

[5]Gkogkos AS，Karoussis IK，Prevezanos ID，et al.Effect of Nd：YAG low level laser therapy on human gingival fibroblasts[J].Int J Dent，2015，2015（10）：1-7.

[6]刘方，龙治峰，龙双涟.新生大鼠成纤维细胞原代培养[J].中南医学科学杂志，2009，37（4）：379-381.

[7]Chen X，Min Z，Chen S，et al.Peptide-modified chitosan hydrogels accelerate skin wound healing by promoting fibroblast proliferation， migration， and secretion[J]. Cell Transplant，2017，26（8）：1331.

[8]钟建桥，胡念芳，李利.真皮干细胞与皮肤衰老关系的研究进展[J].中国皮肤性病学杂志，2010，24（5）：479-481.

[9]李玉平，张晓光，郭兵申，等.沙利度胺对人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响[J].中华皮肤科杂志，2016，49（12）：857-860.

[10]程小皙，刘士强，周毕峰，等.CO2剥脱性点阵激光与1 550nm非剥脱性点阵激光治疗痤疮瘢痕的研究现状[J].中国美容整形外科杂志，2017，28（3）：187-189.

[11]Kopera D，Smolle J，Kaddu S，et al.Nonablative laser treatment of wrinkles： meeting the objective？assessment by 25 dermatologists[J].Br J Dermatol，2015，150（5）：936-939.

[12]李志清，潘宁，戴耕武，等.脉冲染料激光联合Nd：YAG治疗颌面部草莓状血管瘤的疗效分析[J].中国激光医学杂志，2010，19（1）：35-37.

[13]徐潇，刘晓燕，卞媛媛，等.1 320nm&1 440nm非剥脱性点阵激光治疗面部皮肤老化指标改善的量化分析[J].中国美容整形外科杂志，2011，22（5）：291-294.

[14]Alshami MA.New application of the long-pulsed Nd-YAG laser as an ablative resurfacing tool for skin rejuvenation： a 7-year study[J].J Cosmet Dermatol，2013，12（3）：170.

[15]马明远，柏春伟，李宇.Q开关翠绿宝石激光治疗皮肤色素性病变的临床效果[J].中华医学美学美容杂志，2014，20（4）：308-309.

[16]Dang Y，Ren Q，Hoecker S，et al.Biophysical， histological and biochemical changes after non-ablative treatments with the 595 and 1 320 nm lasers： a comparative study[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed，2005，21（4）：204-209.

[17]Dang Y，Ye X，Weng Y，et al.Effects of the 532-nm and 1，064-nm Q-switched Nd：YAG lasers on collagen turnover of cultured human skin fibroblasts： A comparative study[J].Lasers Med Sci，2010，25（5）：719-726.

[18]劉华绪.非磨削激光胶原重组及无刨检测的实验研究[D].上海：上海交通大学，2007：1-124.

[19]马彦，冯文莉，杨静，等.调Q开关翠绿宝石激光治疗282例色素性皮肤病临床分析[J].中国药物与临床，2013，13（3）：301-304.

[20]李雪萍，周阳阳，夏文华.810nm半导体激光与755nm翠绿宝石激光脱毛效果的比较[J].中国医药导报，2014，11（15）：57-60.

[收稿日期]2018-06-25 [修回日期]2018-08-15

编辑/朱婉蓉